中心組合設計優化嗜酸乳桿菌NCU402增菌培養基*

熊濤，王昕悅，楊正楠，姜亞茹，黎洪葉

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌，330047)

嗜酸乳桿菌作為胃腸道系統中重要的微生物種類之一，當其活菌數量大于106CFU/mL時，能有效地平衡人體消化道中有益、中性和有害微生物之間的平衡，有很好的益生功能［1-4］。乳酸菌菌劑制備的關鍵在于其高密度培養，而增菌培養基的優化是高密度培養的基礎［5-6］。嗜酸乳桿菌的營養要求復雜，需要氨基酸、核苷酸、單糖或寡糖、維生素等多種物質［7-8］，并且營養物質濃度要恰當合理［9］。響應面法是通過擬合因素和響應值的多元二次回歸方程，能精確分析各因子與響應值的關系，尋求最優工藝參數，具有次數少、周期短、精度高等優點［10-11］。較為常用的響應面分析設計方法有中心組合設計和Box-behnken設計(BBD)，相比BBD而言，CCD具有旋轉性，可考慮因素交互作用，能預估曲率等優點［12-13］。

本研究通過二水平部分因子設計和中心組合設計等方法，以期獲得LaNCU402高密度發酵液，為后期真空冷凍干燥菌劑制備和相關產品研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus NCU402)(以下簡稱LaNCU402):由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏提供。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基［14］:蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母粉 4.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐溫 80 1.0 mL、K2HPO4·7H2O 2.0 g、NaAc·3H2O 5.0 g、檸檬酸三銨 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g，將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調節pH值為6.2，121℃高壓滅菌20 min;此培養基用于菌種活化、復壯。

MRS固體培養基:在MRS液體培養基成分中再加入1.5%～2.0%瓊脂粉，煮沸混勻調節pH后于121℃滅菌20 min;此培養基用于活菌計數。

酵母浸出液培養基:酵母抽提物5.0 g，葡萄糖15.0 g，將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，121℃滅菌20 min。

增菌培養基:按試驗設計添加各培養基成分，煮沸混勻后調整pH值為6.2，121℃滅菌20 min。

1.1.3 生長因子的制備

番茄汁的制備:將新鮮成熟番茄清洗干凈后去蒂去皮，切塊放入榨汁機中榨汁，用紗布過濾2次，取上清液待用。

胡蘿卜汁的制備:將新鮮胡蘿卜挑選清洗后去皮切片榨汁，用紗布過濾2次，取上清液待用。

平菇汁的制備:將鮮菇清洗后切碎，加入一定量蒸餾水榨汁，紗布過濾2次，取上清液待用。

黃豆芽汁的制備:將新鮮黃豆芽洗凈后榨汁，紗布過濾2次，取上清液待用。

黃瓜汁的制備:將新鮮黃瓜清洗后削皮切塊后榨汁，紗布過濾2次，取上清液待用。

啤酒:11°P青島啤酒。

1.1.4 主要試劑

脫鹽乳清粉D90(食品級、美國Davisco國際食品公司);葡萄糖分析標準品、乳酸分析標準品(美國Sigma公司);其他試劑均為國產分析純。

1.1.5 儀器及設備

PB203-N型分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司;MJ-BL25C3型攪拌機，美的集團股份有限公司;C21-SK2105型多功能電磁爐，美的集團股份有限公司;雷磁PHS-25型數顯pH測定儀，上海精密科學儀器有限公司;DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;YXQ-LS50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠;BHC-1300ⅡA/B3型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司;ZSD-A1160A生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司;Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;Aminex-87H色譜柱，伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

取凍存LaNCU402甘油管，室溫靜置5 min后接于MRS液體培養基中，37℃靜置培養20 h后傳代復壯1～2次，備用。

1.2.2 增菌培養

將活化后的LaNCU402以4%(v/v)的接種量接入各增菌培養基，于37℃靜置培養20 h后，測定活菌濃度。

1.2.3 活菌濃度測定

采用MRS平板菌落計數法(GB/T 4789.35-2010食品衛生微生物學檢驗食品中乳酸菌檢驗)。

1.2.4 發酵液中葡萄糖和乳酸的測定［15］

將發酵液在12 000 r/min下離心10 min，取上清液經0.22 μm水系濾膜過濾，得到的濾液用于高效液相色譜分析。色譜條件:進樣量20 μL，流動相為6 mmol/L H2SO4溶液，流速為 0.5 mL/min，柱溫 45℃，紫外檢測器檢測波長205 nm。選用示差折光檢測器檢測葡萄糖，紫外檢測器檢測乳酸。

1.3 實驗設計

1.3.1 增菌培養基單因素試驗設計

1.3.1.1 基礎培養基的選擇

以酵母浸出液培養基、乳清粉培養基、脫脂乳培養基、MRS液體培養基為基礎培養基進行增菌培養20 h，每隔4 h進行活菌計數，確定適合LaNCU402生長的基礎培養基。

1.3.1.2 生長因子優化

在基礎培養基中添加不同含量的生長因子:番茄汁、黃瓜汁、平菇汁、黃豆芽汁、胡蘿卜汁、脫脂乳、11°P啤酒添加量為10%(v/v)，菊糖、低聚果糖、脫鹽乳清粉D90、乳糖、大豆蛋白胨、半胱氨酸、水解酪蛋白添加量為10 g/L，VC和VB1添加量為0.2 g/L;增菌培養后確定LaNCU402的最優生長因子。

1.3.2 二水平部分因子設計

在前期單因素試驗基礎上，選取葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、牛肉膏(C)、酵母粉(D)、檸檬酸三銨(E)、K2HPO4·7H2O(F)、MgSO4·7H2O(G)、MnSO4·4H2O(H)、NaAc·3H2O(J)、乳糖(K)、番茄汁(L)共11個因素，各因素水平取值見表1，以嗜酸乳桿菌的活菌濃度為響應值進行試驗分析。

表1 二水平部分因子設計的因素和水平Table 1 Factors and levels of Fractional Factorial Design

1.3.3 最速上升法設計

響應面擬合方程的最優鄰域才能充分反映真實情形，最速上升法可以迅速的達到其附近［16］。根據部分因子設計試驗結果中顯著因子的效應大小篩選出最大影響因子:牛肉膏(C)、乳糖(K)、番茄汁(L)，并確定最陡爬坡試驗的方向和步長，剩余因子均取低水平值，通過活菌濃度的變化趨勢，確定中心組合設計試驗中3因素的中心點。

1.3.4 中心組合設計

根據FFD試驗和SA試驗中確定的試驗因素和中心點，采用Box-Wilson法進行響應面優化(見表2)，從而獲得最佳培養基。

1.3.5 驗證性試驗

把LaNCU402以4%(v/v)的接種量分別接種在液體MRS培養基中和優化培養基中，37℃下培養96 h，0～40 h內每隔2 h取樣，40～96 h內每隔4 h取樣。每次取樣測其活菌濃度、發酵液pH值、優化后發酵液中葡萄糖及乳酸含量;并以培養時間為橫坐標，繪制各自變化曲線。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels of Central Composite Design

本研究均使用Design-expert V8.06.01進行試驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗篩選嗜酸乳桿菌NCU402基礎培養基組成成分

2.1.1 基礎培養基的確定

以酵母浸出液培養基、乳清粉培養基、脫脂乳培養基、MRS液體培養基4種培養基進行培養后結果如圖1所示。MRS培養基的活菌濃度最高，其次為酵母浸出液培養基。乳清粉培養基在培養時，對數期初期活菌濃度略高于MRS培養基，但對數期時發酵液出現絮狀沉淀，推測為LaNCU402產生的乳酸造成乳清粉中蛋白質沉淀，之后活菌濃度不升反降。因此選擇MRS培養基作為基礎培養基，對其進行優化尋找適合LaNCU402的最佳增菌培養基。

圖1 不同培養基中LaNCU402生長曲線Fig.1 Growth curve of LaNCU402 in different culture mediums

2.1.2 生長因子的確定

不同生長因子對LaNCU402的增菌結果見圖2，除菊糖、低聚果糖、半胱氨酸外，大部分生長因子對LaNCU402有一定的增殖作用。其中番茄汁、脫鹽乳清粉D90和乳糖的增菌效果顯著［17-18］。但脫鹽乳清粉D90在發酵過程中產生的絮狀沉淀影響菌體分離和菌劑制備，并且增大工業生產中管道清洗的工作量，故選取乳糖和番茄汁作為LaNCU402的生長因子。

圖2 不同生長因子對LaNCU402生長的影響Fig.2 Effect of different nutriments on the growth of LaNCU402

2.2 二水平部分因子設計篩選培養基組成最大影響因子

以LaNCU402活菌濃度(107CFU/mL)為響應值進行試驗，設計矩陣和結果見表3，各因素的效應分析見表4，圖3為各因素Pareto圖。

圖3 各因素Pareto圖Fig.3 Pareto chart of main effect

由表4的效應值和各因素Pareto圖可知:葡萄糖、蛋白胨、檸檬酸三銨和乙酸鈉對LaNCU402為負效應，即隨著添加量的增大，LaNCU402活菌濃度呈現降低趨勢;由表4的P值和Pareto圖中超越t-Value Limit線的因素可知，牛肉膏對活菌濃度的增長有顯著效果，乳糖和番茄汁對活菌濃度的影響極顯著。該模型的決定系數為94.51%，校正后的決定系數有79.42% ＞70%，并且模型的P值為0.0456，證明該模型能較好的擬合數據，體現實際情況。分析后選擇牛肉膏、乳糖、番茄汁3個因素作為主要研究對象，對LaNCU402增菌培養基進行進一步優化。

2.3 最速上升法確定響應面最優鄰域

牛肉膏、乳糖、番茄汁3個因素對LaNCU402均為正效應，因此上升方向為各因素濃度梯度遞增;以低水平(-1)到高水平(+1)的1/4為步長進行最速上升試驗，具體試驗設計及結果如表5所示。

表3 二水平部分因子設計矩陣和結果Table 3 Matrix and results of Two-level Fractional Factorial Design

表4 二水平部分因子設計各因素主效應分析結果Table 4 Results of main effect analysis of Two-level Fractional Factorial Design

表5 最速上升試驗設計及結果Table 5 Designand results of steepest ascent

由表5的數據分析可知，隨著3個因素濃度的增大，LaNCU402活菌濃度為逐漸增大后減小，在序號5組達到最高值。此時各因素含量為:牛肉膏1.2%、乳糖2.25%、番茄汁30%。取5組中各因素含量，其余因素取低水平值，以此為中心組合設計因素水平的中心點，進行Box-Wilson試驗。

2.4 中心組合設計優化嗜酸乳桿菌NCU402增菌培養基

以牛肉膏(W)、乳糖(X)、番茄汁(Y)3個因素為自變量，LaNCU402活菌濃度為響應值，通過Design-expert軟件設計3因素5水平的Box-Wilson試驗，試驗設計和結果如表6所示，軟件分析后得到回歸方程的參數估計和方差分析，見表7、表8。

進行二次多項回歸擬合后得到擬合回歸方程為:

y=2.760 30+0.093 82W-0.053 07X+0.104 66Y-0.147 5WX-0.280 85WY+0.117 5XY-0.255 47W2-0.178 29X2-0.178 85Y2

表6 中心組合試驗設計及結果Table 6 Designand Results of Central Composite Design

表7 回歸方程參數估計Table 7 Parameter estimation of regression equation

表8 回歸方程方差分析Table 8 Variance analysis of regression equation

式中:y為LaNCU402活菌濃度預測響應值;W為牛肉膏的編碼值;X為乳糖的編碼值;Y為番茄汁的編碼值。

由表7的參數估計和顯著性分析可知，各因素對LaNCU402活菌濃度的線性效應均顯著，影響程度番茄汁＞牛肉膏＞乳糖;各因素交互項和二次項均為極顯著，3因素之間的交互作用較大。

表7中，該模型的決定系數為97.68%，校正后的決定系數為95.36%，可說明該模型擬合度好，對真實情況有高度相關性，只有總變異4.64%的情況不能用該模型解釋;而變異系數(C.V.)為3.68%，說明模型精準度較高，模型可信;由表8可知，該回歸方程的Prob＞F值小于0.0001，只有0.01%的機會出現噪聲，說明模型差異極顯著;并且失擬檢驗的Prob＞F值為0.2731＞0.05，可見失擬項對于純誤差不顯著，進一步說明該模型能較好擬合實際情況;因此可利用該模型對LaNCU402的生物量進行預測。

由擬合方程可繪制響應面三維分析圖和相應的等高線圖(圖4)。每個響應面三維分析圖和對應的等高線圖分別為當一個變量保持0水平時，另2個獨立變量之間的交互作用。

圖4(A)為Y(番茄汁)含量為編碼0值時，W(牛肉膏)和X(乳糖)的交互作用的等高線圖和相應的響應面三維分析圖。分析可知，當乳糖含量一定時，隨著牛肉膏添加量的增大，LaNCU402的活菌濃度先增大后減小;由于嗜酸乳桿菌的不完全蛋白分解酶系，蛋白質分解能力弱;而嗜酸乳桿菌需要較多外界提供的營養如氨基酸、肽、核酸衍生物等，而牛肉膏當中含有豐富的氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質類及維生素類等等營養物質，在一定程度上可以滿足菌體的增殖。當牛肉膏含量一定時，隨著乳糖添加量的增大，LaNCU402的活菌濃度先增大后減小;當乳糖濃度恰當時，可以作為LaNCU402的碳源，但當乳糖濃度過大時，大量增殖產生的乳酸會對抑制菌體增殖［19］。

圖4的B圖為X(乳糖)含量為編碼0值時，W(牛肉膏)和Y(番茄汁)的交互作用的等高線圖和相應的響應面三維分析圖，該圖呈橢圓形，證明二者交互作用較大。當牛肉膏處于-1-0.5水平時，隨著番茄汁含量的增加，活菌濃度也隨著增大;當番茄汁處于-1-0水平時，活菌濃度與牛肉膏含量呈正效應;而當番茄汁和牛肉膏含量均為高水平時，活菌濃度反而降低。分析認為番茄汁和牛肉膏均為天然產物，可以給LaNCU402帶來較全面的營養物質，其中所含的B族維生素和氨基酸都能促進LaNCU402的生長;但當二者含量均高水平時，可能由于物質濃度的升高造成高滲透壓和氧化還原電勢，造成細胞死亡，抑制了嗜酸乳桿菌的增長［20］。

圖4 各因素交互作用響應面圖及相應的等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour map of interactive effects of various factors

圖4的C圖為W(牛肉膏)含量為編碼0值時，X(乳糖)和Y(番茄汁)的交互作用的等高線圖和相應的響應面三維分析圖。由圖分析有:當番茄汁處于較低水平時，乳糖含量的增加也不能使LaNCU402達到最高活菌濃度，因此番茄汁的增加有利于乳糖對LaNCU402的增殖。

圖4的結果分析可知，活菌濃度y的最大值既是所得回歸方程存在的最高點。對回歸方程求解最大值可得:當 W=0.215 3、X=-0.214 9、Y=0.053 43，即當牛肉膏為1.458 4%、乳糖為1.766 5%、番茄汁為31.602 9%時，LaNCU402的活菌濃度y達到最大值2.779×109CFU/mL。

2.5 驗證試驗確定模型準確性

為了驗證最優培養基和增菌效果的可靠性，以初始MRS培養基為對照進行驗證試驗，其活菌濃度、發酵液pH值、發酵液中葡萄糖及乳酸含量的變化曲線結果如圖5、圖6所示。

從LaNCU402在MRS和優化培養基中的生長曲線可以看出，對數期大大縮短，由8h提前到4h，穩定期由16 h提前到14 h，證明優化后的培養基更加有利于LaNCU402的生長;整個生長周期中MRS培養基的最大活菌濃度為5.733×108CFU/mL，優化培養基最大活菌濃度為2.8833×109CFU/mL，與模型預測值基本吻合。而pH變化曲線可以看出優化培養基中大量增殖菌體所產生的乳酸多于MRS培養基，在對數期時下降速率較快，對之后進行培養條件優化中的堿流加有著指導意義。

圖5 LaNCU402在兩種培養基中的生長曲線和pH變化曲線Fig.5 pH and growth curve of LaNCU402 in two cultures

圖6 LaNCU402在優化培養基中葡萄糖和乳酸的變化曲線Fig.6 the curves of glucose and lactic acid in the optimal culture of LaNCU402

用高效液相色譜測定優化后LaNCU402發酵液中葡萄糖及乳酸含量，以培養時間為橫坐標，繪制各自變化曲線。由圖6知，在對數期時，葡萄糖的消耗大大增加，在36 h后趨于穩定，從40 h到72 h有緩慢增加趨勢，分析估計是由Cori循環生成［21］;在對數期末期到穩定期，乳酸的生成速率達到最大，在22 h后平穩增長。該組數據測定對之后培養條件優化中底物流加具有指導意義。

3 結論

本研究篩選出LaNCU402生長的最大影響因子，通過中心組合設計對增菌培養基進行優化，得到優化培養基為:葡萄糖1.5%、蛋白胨1%、牛肉膏1.458 4%、酵母粉 0.4%、檸檬酸三銨 0.2%、K2HPO40.2%、MgSO4· 7H2O 0.02%、MnSO4· 4H2O 0.005%、NaAc·3H2O 0.5%、乳糖1.766 5%、番茄汁31.602 9%、吐溫80 0.1%;活菌濃度可達到2.883 3×109CFU/mL，對比MRS培養基有著明顯的提高，為之后培養條件的優化和真空冷凍干燥打下基礎。

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