1株從冰葡萄汁中分離的德巴利酵母菌的鑒定及耐性研究*

劉壯，冮潔，涂茂林，謝彬，胡文忠，張平

1(大連民族大學生命科學學院，遼寧大連，116600)2(遼寧五女山米蘭酒業有限公司，遼寧 本溪，117201)

冰葡萄酒是以自然條件下冰凍的葡萄為原料，在結冰狀態下壓榨，低溫發酵，釀制而成的甜葡萄酒。由于其獨特濃郁的甜香、醇厚風味，加上繁復、嚴謹、漫長的釀造過程使其身價倍增，因而被譽為“液體黃金”［1］。冰葡萄酒是冰葡萄汁經低溫發酵而成的，由于冰凍的葡萄中的水分一部分蒸發，一部分結冰。因此，冰葡萄汁的糖、酸得到濃縮，使冰葡萄汁具有很高的滲透壓和黏度，這要求發酵冰葡萄酒的酵母菌要具有很強的耐受性。目前我國冰葡萄酒發酵主要采用的是進口的釀酒酵母，如德國的W15，法國的K1、RHST、KD、DV10、EC1118 等［2］。我國自主品牌的冰葡萄酒發酵酵母很少。黃英子對甘肅祁連酒莊冰酒主栽品種(美樂、貴人香)自然發酵和接種發酵過程中采集到的酵母菌株進行歸類鑒定，美樂冰紅中共分離到6屬6種酵母菌:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、耐熱克魯維酵母(Lachancea thermotolerans)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、核果梅奇酵母(Metschnikowia aff.fructicola)和亞膜漢遜酵母(Pichia subpelliculosa)，貴人香冰白中共分離到6屬8種:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、耐熱克魯維酵母(Lachancea thermotolerans)、核果梅奇酵母(Metschnikowia aff.fructicola)、嗜高壓有孢漢生酵母(Hanseniaspora osmophila)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)［3］。趙新節在云南德欽產區的赤霞珠冰葡萄自然發酵過程中發現5種酵母菌，分別為 Cryptococcus flavescens、Cryptococcus amylolentus、Hyphopichiapseudoburtonii、Hanseniasporauvarum、Saccharomyces cerevisiae［4］。本文主要對 1株從遼寧本溪種植的威代爾冰葡萄汁中分離獲得的冰葡萄酒發酵性能優良的酵母菌進行鑒定和耐性研究，為豐富冰葡萄酒發酵酵母菌的種類，利用本土優良酵母資源發酵冰葡萄酒提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

冰葡萄汁，遼寧本溪五女山米蘭酒業提供的威代爾冰葡萄汁。

YEPD培養基(g/L):葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，氯霉素0.2，瓊脂40.0，酵母膏10.0;

WL培養基(g/L):葡萄糖50.0，胰蛋白胨5.0，酵母粉 5.0，KH2PO40.55，KCl 0.425，CaCl20.125，MgSO40.125，MnSO40.002 5，FeCl30.002 5，溴甲酚綠0.022，瓊脂17.0;

葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、溴甲酚綠、KH2PO4、FeCl3、MnSO4、MgSO4、CaCl2試劑均購自上海晶純生化科技股份有限公司。

BS 223S電子精密天平，賽多里斯科學儀器(北京)有限公司;ZHJH-C2112B無菌操作臺，上海智城分析儀器制造有限公司;UV-2000紫外可見分光光度計，UNICO;HNY-100B恒溫培養振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司;H2050R臺高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離純化

冰葡萄汁進行10倍梯度稀釋后取0.1 mL涂布于YEPD平板培養基上，28℃恒溫培養3 d，得到單菌落，分別挑取不同形態的單菌落再次劃線接種于YEPD培養基中，28℃恒溫培養培養3 d，將得到的酵母菌單菌落接種于YEPD培養基斜面，28℃恒溫3 d，然后放于 -4 ℃冰箱中保存［5］。

1.2.2 酵母菌的形態觀察

(1)菌落特征觀察:將分離純化得到的酵母菌平板劃線接種于WL鑒別培養基，28℃恒溫培養5 d，觀察培養基中菌落的特征［6-7］。

(2)細胞形態觀察:挑取純化得到的酵母菌，用1%呂氏美藍染色劑染色，分別制片，在顯微鏡下觀察酵母菌的形態［8］。

1.2.3 生理生化實驗

1.2.3.1 葡萄糖發酵實驗:參照文獻［9-10］進行。

1.2.3.2 KNO3同化實驗:參照文獻［11-12］進行。

1.2.3.3 尿素分解實驗:參照文獻［10-12］進行。

1.2.3.4 肌醇同化實驗:參照文獻［12］進行。

1.2.4 酵母菌的分子鑒定

酵母菌的分子鑒定的方法采用26S rDNA D1/D2區序列分析。將保存的菌種委托寶生物公司進行測序，將測序結果輸入 www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST軟件，將測得的基因序列與Genbank數據庫的序列進行同源性比較。結合形態學等特性確定酵母菌種屬［13-14］。

1.2.5 酵母菌的耐性試驗

酵母菌液的制備:挑取試管保存的酵母菌于裝有100 mL富集培養基的三角瓶中，28℃搖床(130 r/min)培養48 h，再將此酵母液稀釋到1 L，得到酵母菌活化液，酵母菌濃度達到2×107個/mL，于 -4℃保存待用。酵母菌菌體濃度用血球計數板測定［15］。

耐糖能力實驗:取滅菌后的10 mL試管，加入9.0 mL 的蔗糖質量濃度分別為 200、250、300、350、400、450g/L的液體培養基，再加入1.0 mL酵母菌液，于28℃搖床(130 r/min)培養24 h。測定600 nm下菌液的OD值，從而確定酵母菌對糖的耐受情況［15-16］。

耐SO2能力實驗:取滅菌后的10 mL試管，加入9.0 mL 質量濃度分別為 60、120、180、240、360、420 mg/L的SO2液體培養基，再加入1.0 mL冰葡萄酵母活化液，28℃搖床(130 r/min)培養24 h。測定600 nm下菌液的OD值，從而確定酵母菌對SO2的耐受情況［15，17］。

耐乙醇能力實驗:取滅菌后的10 mL試管，加入9.0 mLC2H5OH 濃度分別為 70、90、110、130、150、180 mL/L的液體培養基，再加入1.0 mL冰葡萄酵母活化液28℃搖床(130 r/min)培養24 h。測定600 nm下菌液的OD值，從而確定酵母菌對乙醇的耐受情況［15-16］。

耐酸能力實驗:取滅菌后的10 mL試管，分別加入9.0 mL的液體培養基，使 pH分別為:2.4、2.8、3.2、3.4、3.8，再加入1.0 mL 冰葡萄酵母活化液，于28℃搖床(130 r/min)培養24 h。測定600 nm下菌液的 OD值，從而確定酵母菌對 pH的耐受情況［15-16］。

2 結果與討論

2.1 酵母菌的分離純化結果

采用1.2.1酵母菌的分離純化方法從威代爾冰葡萄汁中共分離到60株酵母菌，對這60株酵母菌進行了形態學、生理生化和分子生物學鑒定，獲得德巴利酵母(Debaryomyces)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)等菌株。由于首次在冰葡萄汁中分離獲得德巴利酵母。因此，對其形態特征、生理生化特性和耐受性進行了詳細的研究。

2.2 WL培養基菌落形態觀察結果

將分離純化得到的德巴利酵母接種于WL鑒別培養基上進行形態聚類，德巴利酵母在WL培養基上呈現一種形態，如圖1所示，表現為:中央淡綠色，周圍白色，略凸起，表面干燥，邊緣整齊。

2.3 德巴利酵母細胞形態觀察結果

通過顯微鏡對德巴利酵母菌體形態進行觀察，結果如圖2所示。德巴利酵母細胞為橢圓形，平均大小為 4.5 μm ×5.4 μm，呈出芽繁殖。

2.4 生理生化實驗結果

2.4.1 葡萄糖發酵實驗

以葡萄糖為碳源的酵母菌，能發酵葡萄糖產生丙酮酸通過三羧酸循環等復雜代謝途徑形成酸性代謝產物使溴甲酚紫指示劑變為黃色。如果代謝過程伴有產氣，則在指示劑變黃的同時小杜氏管中有氣泡出現［9-10］。實驗結果如表1所示，從第2天開始，培養基的顏色從紫色漸漸變為黃色，第4天時顏色基本為黃色，之后顏色保持不變。在這7天中始終無產氣現象。說明德巴利酵母能發酵葡萄糖形成酸性代謝產物，但代謝過程不產生氣體。

圖1 德巴利酵母WL培養基鑒別結果Fig.1 The result of Debaryomyces identification on WL medium

圖2 德巴利酵母顯微鏡觀察結果(×1000)Fig.2 The result of Debaryomyces observation by the microscope

表1 德巴利酵母葡萄糖發酵實驗結果Table 1 The results of Debaryomyces glucose fermentation experiment

2.4.2 KNO3同化實驗

德巴利酵母在不含氮源但添加了KNO3的培養基中培養7 d后，培養基變渾濁，說明該德巴利酵母的生長情況良好。同時觀察到德巴利酵母在培養液中并未形成菌膜或菌環。

2.4.3 尿素分解實驗

有些酵母菌能產生脲酶，可分解尿素形成大量的氨，使得培養基 pH升高，使酚紅指示劑顯紅色［10-12］。

分離純化的德巴利酵母在尿素分解培養基上培養，培養基始終未變紅，說明該酵母菌不能產生脲酶。

2.4.4 肌醇同化實驗

分離純化的德巴利酵母接種入肌醇同化培養基，培養7 d后，觀察到培養基未變渾濁，說明該酵母菌的生長情況較差，不能利用肌醇作為碳源，同時觀察到培養液中沒有形成菌膜或菌環。

2.5 德巴利酵母的分子鑒定

對酵母菌的26S rDNA D1/D2區序列分析，如圖3所示，分離到的酵母菌的PCR產物長度為557 bp。電泳圖中的陽性對照是試劑盒中的Control DNA的PCR擴增產物，條帶清晰，大小正確，說明所使用擴增體系正確，陰性對照是試劑盒中的dH2O的PCR擴增產物，說明擴增的過程中不存在DNA污染。

圖3 德巴利酵母26S rDNA D1/D2區PCR產物電泳圖譜Fig.3 The PCR electrophoretogram of Debaryomyces 26S rDNA D1/D2 region

將測序結果輸入 www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST軟件，將測得的基因序列與 Genbank數據庫的序列進行同源性比較。序列NCBI BLAST比對結果見表2。

在表2中，匹配分值與總體分值為比對得分，分值越高，兩個序列相似性越高。隨機匹配可能性越小，可信度越高，它的值接近零或為零時，代表完全匹配。由表2可以看出分離得到的酵母菌與各株漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的同源性均達到100%，結果表明分離得到的酵母菌屬于德巴利酵母屬。德巴利酵母能發酵葡萄糖產D-阿拉伯糖醇顯著改善酒精飲品的品質［18］。也可以在受傷的柑橘表面快速繁殖，對柑橘保護酶的誘導有積極作用，抵御病蟲害［19］。還用于生產優質飼料用菌體蛋白［20］。

表2 德巴利酵母的序列比對分析結果Table 2 The results of Debaryomyces sequence comparison and analysis

2.6 酵母菌的耐受性實驗結果

2.6.1 德巴利酵母對糖的耐受情況

冰葡萄汁具有含糖量高的特點，通常其含量為350～420 g/L。因此優良的冰酒酵母菌必須具有良好的耐糖性。該株德巴利酵母對糖的耐受性如圖4所示。含糖量為250 g/L時最適宜其生長，在含糖量為450 g/L時仍具有較高生長量，菌體濃度為2.1×107個/mL，說明其耐糖性能較好，可作為冰酒釀造的菌種。

圖4 德巴利酵母對糖的耐受結果Fig.4 The results of Debaryomyces glucosetolerance experiment

2.6.2 德巴利酵母對SO2的耐受情況

冰酒的釀造過程中會添加一定量的SO2，因此酵母菌對SO2的耐受情況也應作為篩選酵母菌的指標。由圖5可得出結論:該株德巴利酵母的生長量隨SO2濃度的升高而降低，但當SO2的濃度達到420 mg/L時，菌體濃度仍可達到1×107個/mL，表現出了對SO2良好的耐受性。

圖5 德巴利酵母對SO2的耐受結果Fig.5 The results of Debaryomyces sulfur dioxide tolerance experiment

2.6.3 德巴利酵母對乙醇的耐受情況

成品冰酒的酒精度一般為11o，性狀優良的酵母菌必須具備能耐高酒精度特點。由圖6可知:該株德巴利酵母對乙醇有一定的耐受性，乙醇含量達到18%時，OD600nm為0.031，菌體濃度為 4 ×106個/mL，表現出對乙醇具有較好的耐受性，可用于冰酒釀造過程中。

2.6.4 德巴利酵母對酸的耐受情況

冰葡萄汁的pH一般為3.3左右，因而優良的酵母菌種應具備耐酸的能力。由圖7酵母菌對pH的耐受結果可以看出:該株德巴利酵母在pH為3.2時生長量為最大，菌體濃度達到1.5×107個/mL，表明具有較好的酸耐受性，可在冰酒釀造過程中使用。

圖6 德巴利酵母對乙醇的耐受結果Fig.6 The results of Debaryomyces alcohol tolerance experiment

圖7 德巴利酵母對pH的耐受結果Fig.7 The results of Debaryomyces acid tolerance experiment

3 結論

本研究從遼寧本溪地區的威代爾冰葡萄汁中共分離獲得60株酵母菌，對這60株酵母菌進行了形態學、生理生化和分子生物學鑒定，鑒定出德巴利酵母(Debaryomyces)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)等菌株，說明遼寧本溪地區冰葡萄上的酵母菌具有較好的多樣性。為研究本土葡萄釀酒微生物資源的生物多樣性，分離收集優質葡萄酒產區酵母菌株提供參考。

本研究首次在冰葡萄汁中分離獲得德巴利酵母菌，通過德巴利酵母的耐受性實驗結果可以看出:該株德巴利酵母對糖、SO2、乙醇和酸均有較強的耐受性。在含糖量450 g/L、SO2濃度420 mg/L、乙醇含量18%、pH 3.8時，仍可保持106個/mL以上的生物量，說明分離獲得的該株德巴利酵母適合應用在冰葡萄酒的釀造中。雖然德巴利酵母能發酵葡萄糖產D-阿拉伯糖醇顯著改善酒精飲品的品質［18］，但還未應用到冰酒釀造過程中。在未來研究中，可作為增香菌株，與釀酒酵母共同發酵，為生產出更具地方特色，風格獨特的冰葡萄酒奠定物質基礎。

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