食品腐敗中細菌群體感應現象的研究進展*

李學鵬，陳桂芳，儀淑敏，朱軍莉，李婷婷，李春，勵建榮

1(渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)

2(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州，310012)3(大連民族學院生命科學學院，遼寧 大連，116600)

4(渤海大學數理學院，遼寧錦州，121013)

食品腐敗是一個復雜的過程，其中微生物作用是引起食品腐敗變質的主要因素之一。微生物通過分解蛋白質、脂質及糖類等營養物質進行生長繁殖，進而導致食品腐敗，從而導致巨大的經濟損失和嚴重的公共衛生問題［1］。近年來，腐敗食品中群體感應(quorum sensing，QS)系統的發現為研究食品腐敗機理提供了新的方向。QS通過產生信號分子即自體誘導物(autoinducers，AI)介導細菌間的交流［2］，細菌通過QS機制以細胞密度變化為依據表達特定基因。QS參與調控微生物的多種生活習性以及各種生理過程，如生物發光、抗生素的合成、生物膜的形成、質粒的接合轉移、生物群游現象以及根瘤菌與植物的共生等［3］?，F有研究表明QS參與食品腐敗過程，調控與食品腐敗相關的蛋白質、脂肪、果膠、殼多糖等分解酶活性，并在不同的腐敗食品中檢測出了不同類型的QS信號分子［2］。但目前QS系統在食品腐敗中的調控研究尚處于起步階段，人們對QS引起的食品腐敗機制的認識仍十分有限。本文主要介紹了細菌QS產生機制、信號分子及檢測方法、QS研究前沿，重點綜析了QS與食品腐敗的關系，展望了群體感應抑制劑的開發前景，旨在為深層次揭示微生物引起的食品腐敗機制，建立以靶向控制細菌QS為基礎的食品保鮮新技術提供理論依據。

1 群體感應現象及其發生機制

細菌在生長環境中，能夠感知周圍環境中細菌的密度進而調控自身行為的現象稱為群體感應現象。這一現象只有在細菌數量達到一定閾值時才會發生，因此又稱其為細菌密度依賴型基因表達調控［3］。目前研究表明，QS在細菌繁殖中主要參與毒力的調節，感受態的形成，接合質粒的轉移，抗生素的產生調控以及生物膜的形成等［4］。細菌利用群體感應監控自身群體密度的變化，在繁殖過程中會分泌一些特定的QS信號分子，信號分子從胞內擴散到胞外，當信號分子達到一定閾值時，會與受體蛋白結合，導致受體蛋白構象發生改變，從而激活某些特定基因的表達。不同的細菌所用的QS信號分子類型不同，信號轉導機制也不同。目前研究較為深入的QS信號分子主要有N-?；呓z氨酸內酯(N-acyl-homoserine lactone，AHL)、寡肽類物質(autoinducing peptides，AIPs)、呋喃酰硼酸二酯(autoinducer-2，AI-2)等［5］。

1.1 AHLs介導的群體感應系統

革蘭氏陰性菌中最普遍的QS信號分子是N-?；呓z氨酸內酯(AHLs)，它由一個不變的高度保守的內酯環和一個可變的?；鶄孺溄M成［6］，酰基側鏈的長短、飽和度及3位碳上的取代基都是導致AHL結構不同的因素。但是不同AHL介導的群體感應系統的調控機制都是通過LuxI/R系統(圖1a)，即LuxI蛋白負責信號分子AHL的合成，LuxI酶催化產生AHL排出細胞外，在胞外積累到一定程度時，AHL擴散到胞內與LuxR蛋白結合，形成AI/LuxR復合體，并結合到DNA上，啟動相關基因的表達。

1.2 AIP介導的雙組分感應系統

革蘭氏陽性菌中最普遍的信號分子是修飾的寡肽(AIP)。寡肽以前體肽的形式合成，并在細胞質中由前導肽切割、加工、修飾后結合在ATP轉運蛋白上，由 ComAB基因編碼的 ABC(ATP binding cassette)輸出系統或由其他跨膜蛋白輸出到胞外，當AIP的濃度在胞外達到閾值時，ComD組氨酸激酶會識別到這種信號分子，激發ComE傳感激酶的磷酸化和去磷酸化，ComE一旦被激活，就會促進某些目的基因的表達(圖1b)［8］。該系統中，研究得最廣泛的是金黃色葡萄菌的Agr群體感應系統。金葡菌的自誘導物AIP由AgrD編碼，由AgrB進行硫代內酯環化修飾并運輸到細胞外，當細胞外的AIP濃度達到一定閾值，結合并激活二元信號系統的感應激酶AgrC，AgrC磷酸化激活AgrA，后者激活效應分子RNAⅢ(一個具有調控功能的RNA被稱為RNAⅢ)。AgrA同時激活自身AgrBDCA操縱子的轉錄，形成正反饋，完成金葡菌由低密度狀態向高密度狀態的生理行為轉變［9］。

圖1 三種QS系統調控機制示意圖［7］Fig.1 Schematic diagrams of three kinds of QS system regulation mechanism

1.3 AI-2介導的群體感應系統

該群體感應系統存在于革蘭氏陰性菌和陽性菌之間，常有AI-1和AI-2兩種信號分子參與(圖1c)。AI-2在多種革蘭氏陰、陽性菌中都能夠檢測到，是細菌種間交流的媒介。AI-2由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的代謝副產物合成，經歷了多步酶促反應［10］。SAM的甲基轉移底物，生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，在酶的作用下，SAH生成 S-核糖同型半胱氨酸(SRH)，隨后，LuxS催化SRH生成同型半胱氨酸和4，5-二羥基-2，3-戊二酮(DPD)。DPD 在水存在的條件下環化成幾種呋喃糖，并自發環化成具有活性的AI-2，輸出細胞外［11］，達到一定濃度后與 LuxQU 結合，磷酸化后進一步與LuxO結合，進而調控基因的表達。而AI-1由LuxLM催化產生，與LuxU結合后，沿AI-2的途徑實現目的基因的表達。

1.4 其他QS系統

隨著人們研究的深入，Sperandio［12］等發現 LuxS突變體能合成一種AI-3信號分子來調控毒性因子的產生。研究還發現多種共生細菌都能產生 AI-3。Walters［13］等發現E.coli不依賴LuxS蛋白合成 AI-2分子，突變株中AI-3的缺失是由于甲硫氨酸的前體是草乙酸鹽而非SAM。這表明AI-3可能是一種跨物種QS信號分子，然而AI-3信號尚未在陽性菌種中發現。Barber［14］等首次報道野油菜黃單胞菌(X.campestris pv.campestris，Xcc)產生一種新型信號分子DSF，調控胞外酶和胞外多糖的產生。Ryan［15］表示DSF結構類似物被洋蔥伯克霍爾德菌和銅綠假單胞菌用來調控毒力，并指出DSF是一種調控細菌行為的種間信號分子。

2 QS信號分子的檢測方法

信號分子在細菌QS系統中至關重要，是細菌之間的交談語言。如何快速、準確地檢測細菌是否產生信號分子以及產生的信號分子的種類、環境信號分子的消長變化成為研究細菌QS系統的重要手段。下面介紹各類信號分子的特點及檢測方法:

(1)AHLs:AHL結構的研究需要采用先進的方法，如質譜法、高效液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜-串聯質譜法和核磁共振。不過這些方法操作復雜，費用昂貴，難以成為檢測信號分子的常規方法。此外，還可以利用感應菌株快速、經濟地檢測AHL的類型并定量。目前最常用的感應菌株是紫色桿菌CV026和根癌農桿菌A136(pCF218/pCF372)。

(2)AIP:AIP是一類短肽分子，不能進入微生物細胞內，而是與膜受體蛋白結合啟動信號傳遞。目前，AIP的檢測和定量方法很少且主要應用于nisin(乳酸鏈球菌肽)。已有研究報道了4種以nisin誘導的生物發光和熒光性為基礎的nisin生物學鑒定。所有這些生物學鑒定都牽涉到nisin誘導的啟動子控制下的報告基因，如細菌熒光素酶基因(lux)或者綠色熒光蛋白基因(gfp)。

(3)AI-2:AI-2是一種上下對稱的呋喃硼酸二酯分子，具有雙五圓環結構，是一種種間通用的信號分子。由于AI-2分子濃度低，結構不穩定，使得人們很難通過高效液相色譜或氣相色譜法對其進行化學檢測，然而 BAI-2的檢測依賴一種以 V.harveyi BB170luxN::Tn5為報告菌株的生物學鑒定方法［16］。BAI-2活性以相對活性的形式表示，相對活性可通過測試樣品相對于陰性對照的發光率計算得到。

(4)其他信號分子:1)AI-3。AI-3是一種調控EHEC毒力基因的信號分子。利用由E.coli O157:H7 TEVS232菌株參與的β-半乳糖苷酶試驗可以檢測到 AI-3［12］。2)2-烴基-4-喹諾酮類(AHQs)。利用以lux為基礎的P.aeruginosa AHQ感應菌株檢測AHQs并定性，如 PQS 和2-庚基-4-喹諾酮［17］。

3 QS研究中的前沿進展

目前，QS現象在醫學、環境、農業和食品等領域均被廣泛關注。醫學方面，QS的研究主要集中在致被病菌耐藥性、噬菌體毒力因子表達以及病原菌生物被膜的形成等。Azizian［18］等指出QS能夠維持噬菌體與其宿主的協同進化過程。Somaia［19］等表示引起人類感染的銅綠假單胞菌毒力因子的表達受QS調控。Evelien［20］等研究發現癌細胞轉移可能與群體感應肽有關。環境方面，QS研究主要集中在污水的生物處理、好氧顆粒污泥以及生物膜的菌群結構等的研究。Song［21］等研究發現平衡QS和QS淬滅過程可以優化生物反應器的性能。陳國科［22］研究了好氧顆粒污泥耐受高碳氮負荷過程中的QS系統。植物根部定殖能力是農業領域QS現象的研究熱點。張磊［23］等對酸性有鋁土壤補充了5 mmol/kg Ca2+和30 μmol/kg P，發現其對耐酸根瘤菌的存活、遷移和QS有良好的改善效果。此外，QS抑制劑的篩選也是目前國內外學者爭相關注的焦點［24］。QS在食品中的研究相對起步較晚，已有的研究顯示，QS與食源性致病菌、腐敗菌的生理特性的表達均有密切聯系［8，16］。食品工業已成為我國第一大產業，食品腐敗是影響產業發展的一大問題，研究QS與食品腐敗的關系，從而為從QS抑制角度研發新型食品保鮮技術具有重要意義。

4 QS與食品腐敗的關系

近來關于QS對食品腐敗影響的研究越來越多，各種信號分子在不同的食品體系(牛奶、肉和蔬菜)中逐漸被發現。研究顯示，與食品腐敗相關的特性(蛋白水解活性、嗜鐵素產生以及生物膜形成等)均由群體感應現象調控的［25］。許多與食品腐敗有關的革蘭氏陰性菌均產生AHLs，且在食品貯藏條件下AHLs能夠在食品中穩定累積并發揮作用。因此，腐敗菌可以通過AHLs介導的群體感應現象來調控細菌腐敗特性的表達，在食品的腐敗過程中起著重要的作用。下面主要介紹不同食品種類中QS對腐敗過程的潛在影響:

(1)牛奶和奶制品。該類食品的腐敗主要與許多分解蛋白質的革蘭氏陰性嗜冷細菌有關，主要是假單胞菌。假單胞菌產生的胞外蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶和糖苷酶能引起奶制品的腐敗。鮮乳和巴氏消毒奶中分離得到的少數幾個分解蛋白質的嗜冷菌能夠產生不同的AHLs，這些嗜冷菌包括假單胞菌、沙雷氏菌、腸桿菌和蜂窩哈夫尼亞菌。由此可見，QS可能在牛奶和奶制品腐敗過程中發揮重要作用［26］。Shobharani［27］從發酵乳中分離得到的22種腐敗菌中，50%為假單胞菌屬，并指出其產生的信號分子(HHSL和BHSL)與發酵乳的腐敗有關。近年來，人們從原料乳和巴氏殺菌或超高溫處理的全脂或脫脂奶集裝箱貨運站也檢測到了信號分子。

AHLs介導的QS系統能夠控制變形斑沙雷氏菌B5a產生細胞外脂解酶和蛋白水解酶，這表明沙雷氏菌的QS系統參與了牛奶的腐?。?8］。盡管普通牛奶中含有較低的菌落總數(102CFU/mL)，但是仍能檢測出大量BAI-2信號分子，這表明BAI-2可能參與并調控了牛奶腐敗過程中的種間交流。AI-2分子能經受住80℃的高溫，暗示巴氏殺菌不能破壞調控牛奶變質的 AI-2［29］。

(2)肉和肉制品。鮮肉中含有的微生物菌群主要是腸桿菌、異化鐵還原菌、熱殺索絲菌、假單胞菌和乳酸菌。有氧條件下冷藏(3～8℃)的鮮肉及肉制品主要腐敗菌是假單胞菌。人們已研究發現，新鮮肉制品在有氧冷凍條件下貯藏時，QS參與了肉制品的腐敗和其表面生物被膜的形成［30］。肉制品中已經檢測出了AHLs，且AHLs和蛋白酶共存，有氧冷藏的牛肉和雞中檢測出了多種類型的AHLs，如C4-HSL，3-oxo-C6-HSL，C6-HSL，C8-HSL 和 C12-HSL。有氧條件下冷藏的新鮮肉貨架期是幾天，而真空包裝下冷藏貨架期延長至數星期或幾個月。真空包裝的肉制品中乳酸菌和腸桿菌的菌落總數分別達到108和106CFU/g時，乳酸菌和腸桿菌可共同作用導致腐?。?1］。蜂窩哈夫尼亞菌和沙雷氏菌被認定為真空包裝肉中能產生AHLs的主要菌種，而假單胞菌分離株不能產生達到檢測數量的AHLs［31］。近來，研究發現絞碎的豬肉在5℃和20℃下有氧貯藏時，腐敗樣品中含有AHLs和BAI-2，且 AHLs和 BAI-2的含量5℃時高于20 ℃［32］。Blana［33］等研究發現，AHL 存在于有氧包裝下貯藏于0、5、10和15℃的新鮮絞碎的牛肉中，0℃和5℃下分別貯藏458 h和244 h才產生少量的AHLs，而10℃和15℃下分別在貯藏第110 h和60 h就能夠產生AHLs，這與腸桿菌和假單胞菌數量增長到108～109CFU/mL有關。

(3)魚類和水產品。魚體內小分子化合物的濃度低于肉類，但腐敗過程與肉類相似。魚類腐敗與一種或多種特定腐敗菌有關，國內崔正翠［34］等研究表示大菱鲆在0～10℃冷藏過程中的優勢腐敗菌是腐敗希瓦氏菌，其次是假單胞菌。劉尊英等［35］研究發現凡納濱對蝦優勢腐敗菌菌株1(Aci-1)和菌株2(Aci-2)均為不動桿菌屬，均存在以AHLs為信號分子的群體感應系統，添加外源信號分子AHLs能促進Aci-1菌株生物膜的形成，且呈濃度依賴性。Zhu［36］等利用報告菌株法、薄層色譜法和氣相色譜-質譜聯用技術發現冷凍凡納濱對蝦中存在AHLs、AI-2和環二肽，并發現這些信號分子能夠調控優勢腐敗菌生物被膜基質和胞外蛋白酶的產生。國外Beaz-Hidalgo［37］等表示魚病原體殺鮭氣單胞菌毒力因子的表達受QS調控。Tan［38］等從球形魚中分離到蜂房哈夫尼菌，并利用液質聯用技術檢測出2種短鏈AHLs:3-oxo-C6-HSL和3-oxo-C8-HSL。

(4)果蔬類。果蔬類食品的腐敗主要表現為直觀缺陷，如酶促褐變、異味、敗味或結構損傷。微生物能夠產生一系列分解果膠的酶:果膠酸酯裂解酶、堿性果膠酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶［39］。幾種分解果膠和蛋白質的歐文氏菌和假單胞菌能引起即食蔬菜的變質，如黃豆芽。這些菌株能夠產生一系列的AHLs(主要是3-oxo-C6-HSL和C6-HSL)，并參與到豆芽的腐敗過程中。在豆芽貯藏試驗中發現往豆芽中接種產生AHLs的分解果膠的桿菌(如胡蘿卜軟腐歐文氏菌)能加速豆芽腐敗［40］。豆芽腐敗菌果膠桿菌屬A2JW中也存在這種AHLs調節方式，其果膠酶、蛋白酶、纖維素酶和以含鐵細胞為媒介的嗜鐵素均受3-oxo-C6-HSL調控。相比于接種野生型細菌的豆芽，嗜鐵素試驗中作為陰性對照的不產生AHLs的突變型降低了蛋白酶和果膠酶活性，延緩了產品腐敗，而添加外源3-oxo-C6-HSL恢復了AHLs陰性突變株的腐敗過程［40］。這些研究結果為一些食品微生物腐敗受QS調控表型的影響提供了依據。釀酒廠灌裝機等表面分離到的 Pseudomonas、Enterobacter和Aeromona 等可產生 AHLs分子［41］。

SPⅡ，一種 LuxⅠ同族體，能夠控制至少3種AHLs的產生，分別為 C4-HSL、C6-HSL和3-oxo-C6-HSL。從生鮮蔬菜加工生產線中分離得到的普城沙雷菌RVH1含有該基因。對SPⅡ基因滅活能夠導致3-oxo-C6-HSL的消失以及C4-HSL和C6-HSL生成量的減少。依賴SPⅡ的QS能夠抑制外源幾丁質酶、核酸酶和蛋白酶的產生，也能抑制抗菌化合物和2，3-丁二醇發酵產物的生成［42］。發酵是一些腸桿菌的第一條中心代謝途徑，當細菌到達穩定期時發酵允許其通過限制酸性物質的產生來阻止致命的酸化作用［43］。SPⅡ突變株能夠減少RVH1中一些胞外酶的生成，添加10 μmol/L C6-HSL或3-oxo-C6-HSL能夠恢復，而添加 C4-HSL則不能恢復［42］，這說明在RVH1中 SPⅡ至少能夠調控 C6-HSL和3-oxo-C6-HSL的產生。

與黃瓜腐敗相關的黏質沙雷氏菌MG1(早先是液化沙雷氏菌MG1)的分泌物和丁二醇發酵過程均受SwrI/SwrR QS系統及同源C4-HSL調節，分泌物包括胞外脂酶、PrtA金屬蛋白酶和S-層蛋白質。抑制Swr調節系統對S-層蛋白質和金屬蛋白酶的產生有影響，而對脂酶似乎無影響，該脂酶是由LipB器官分泌［44］。同樣的，一些研究表明沙雷氏菌ATCC39006中SmaI/SmaR QS系統以及其同源物C4-HSL和C6-HSL能夠控制胞外果膠酸酯裂解酶和纖維素的產生［43］。

5 QS 抑制劑(quorum-sensing inhibitors，QSI)

目前已經發現許多干擾細菌QS系統的途徑。大致有以下3種:(1)產生使AHLs滅活的AHLs降解酶，干擾AHLs介導的細菌QS系統，阻止相關基因的表達。如AHL-lactonase，可以破壞酰基高絲氨酸內酯類分子的高絲氨酸內酯環使之失活，又如AHL-acylase，也可以使?；呓z氨酸內酯類分子N-酰基的碳鏈上的酰氨鍵水解使之失活;(2)利用QS系統中的信號分子來誘發抗性，這在植物中比較常見;(3)產生細菌信號分子的類似物與信號分子受體蛋白競爭性結合來阻斷病原菌QS系統。有效的QSI需要滿足以下幾個條件［24］:(1)能夠明顯抑制QS調控的基因表達的小分子化合物;(2)對給定的QS調節劑有高度專一性，且對細菌或宿主沒有反作用;(3)具有化學穩定性，能有效抵抗宿主新陳代謝系統的降解;(4)存活時間較AI長。QSI主要分為兩類:天然的 QSI和合成的 QSI。對于天然 QSI，Shepherd［45］等研究發現丁香假單胞菌B728a可以產生2種降解信號分子 AHL的?；?HacA和 HacC。Issac［46］等發現姜黃素可以抑制人類尿路病原菌生物被膜的形成。Vikram［47］等發現檸檬素能有效抵抗介導生物發光的HAI。由于天然QSI濃度低且毒性小，我們可通過化學合成QSI來避免天然QSI的局限。Morkunas［48］等通過合成AHL信號分子類似物，篩選到可以抑制銅綠假單胞菌QS系統并降低其綠膿菌素產量的化合物。

6 結語

盡管群體感應系統在很多領域都有研究，尤其在醫療、制藥和生物防御等方面已經取得了顯著進展，但是在食品科學研究領域中仍然處于起步階段。隨著生活質量的不斷提高，人們對食品安全性的要求也越來越高，因此，深入探討腐敗菌的QS調控機制及其在食品腐敗中的作用，充分利用現有技術不斷發現或合成QSI，對于延緩食品腐敗變質和保證食品安全性有重要作用。目前，利用水果、海藻、農作物等食源性植物的提取物作為QSI來防止食品腐敗為食品防腐保鮮開辟了新道路。然而，如何高效提取天然QSI，如何有效地利用QSI達到食品貯藏保鮮的目的，是迫切需要研究的問題。另外，通過干擾腐敗菌的QS系統，開發新型的食品“防腐劑”，對食品保藏具有非常重要的意義。隨著對細菌QS系統研究的不斷深入，相信不久的將來這種新型的防腐策略將被應用于實踐。

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