凍藏溫度對魷魚品質的影響*

路鈺希，林玉海，李學英，楊憲時，黃洪亮

1(中國水產科學研究院東海水產研究所，上海，200090)2(上海荷美爾食品有限公司，上海，201900)

魷魚因具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等營養特點，深受廣大消費者的喜愛，已成為北太平洋海域重要的經濟頭足類水產。魷魚的胴體部分約占體重的50%，頭足部分約占體重的30%，故魷魚可食部分達80%以上，比一般魚類高出20%左右，是良好的水產品加工原料［1］。日本從1970年開始利用該資源，中國則從1994年起開發利用，現已成為中國重要的遠洋漁業捕撈對象［2］。

國內、外已有對魷魚加工貯藏中品質變化的研究，吳燕燕［3］等利用無磷品質改良劑研究了其在阿根廷魷魚變性過程中對品質的影響，其中，觀察了改良劑對魷魚浸泡增重率、自由液滴損失率、蒸煮損失率、鹽溶性蛋白、肌原纖維蛋白鈣ATP酶(Ca2+-ATP酶)活性、pH、總揮發性鹽基氮(TVB-N)以及色澤變化的影響;金淼等［4］通過對魷魚肌原纖維蛋白含量、總巰基和活性巰基含量、Ca2+-ATPase活性、質構特性變化的研究，確定了引起秘魯冷凍魷魚蛋白變性的主要生產環節;Paulo Vaz-Pires等［5］對在冰點貯藏下的魷魚感官、微生物及物理化學變化進行了研究。目前國內、外有關凍藏溫度對魷魚品質變化影響的研究還鮮有報道。

近年來，國際上對于水產品儲藏溫度的要求趨于低溫化，英國對所有凍結魚蝦類制品推薦-30℃貯藏;美國認為水產品的凍藏溫度應在-29℃以下;我國對水產品儲藏的溫度沒有嚴格的要求，一般在-20℃左右，這對蝦類、貝類、鰻魚、金槍魚等含脂肪較多的水產品缺乏科學依據，同時，風險較大，因此，探討最佳儲藏溫度對保存具有較高商業價值的水產品具有很大現實意義。本實驗以北太平洋魷魚為研究對象，選擇不同的貯藏溫度(-10、-20、-30和-40℃)，通過分析魷魚持水力(water holding capacity，WHC)、pH、硫代巴比妥酸反應物(tiobarbituric acid reactive substances，TBARS)、甲 醛 (formaldehyde，FA)、鹽溶性蛋白含量(salt soluble protein，SSP)、活性巰基含量和Ca2+-ATPase活性的變化，探討凍藏溫度對魷魚品質變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魷魚樣品:捕撈船于2012年10月在赤道公海區域捕撈，品種為秘魯魷魚，船上凍結后-20℃貯藏運輸至實驗室，-80℃貯藏備用。

JYL-350型絞肉機，上海九陽股份有限公司;MPR-414F型冰箱，Sanyo，日本;SIM-F140AY65制冰機Sanyo，日本;IUL型均質機，西班牙;5810R型高速冷凍離心機，Eppendorf，德國;TMS-Pro型質構儀，Food Technology Corporation，美國;721型可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;PHS-2C酸度計，上海偉業有限公司;YP200N型電子天平，上海菁海儀器有限公司;DK-524型水浴鍋，上海晉理科學儀器有限公司;500mL蒸餾燒瓶裝置，上海長城華美儀器化劑有限公司。

1.2 樣品處理方法和貯藏試驗

魷魚流水解凍，去頭、皮和內臟，胴體切小塊裝袋密封，分別貯藏于［(-10、-20、-30、-40)±0.1］℃冰箱中，分別每隔 10、15、20、30d 取樣，4 種貯藏溫度條件分別取樣7個時間點，測定魷魚持水力、pH、TBARS、FA、鹽溶性蛋白含量、活性巰基含量和Ca2+-ATPase含量。

1.3 實驗方法

1.3.1 持水力的測定

利用TMS-Pro型質構儀，采用濾紙加壓法(filter paper press method)進行測定。取完整肉塊10.0g置于10層濾紙上，另取10片濾紙置于其上，定壓100N壓5min，加壓前后分別稱重，記錄加壓前質量(m1)和加壓后質量(m2)，則加壓條件下的持水力可以用加壓失水率Xp(pressing loss)表示:

式中:Xp，加壓失水率，%;m1，加壓前魷魚質量，g;m2，加壓后魷魚質量，g。

1.3.2 pH值的測定

稱取10.0 g絞碎的樣品，置于100 mL有蓋的三角燒瓶中加入90 mL無菌蒸餾水，浸泡30 min并不時振搖。過濾后取濾液，用便攜式pH測定儀測定，每個樣品至少做2個平行。

1.3.3 TBARS的測定

［6］，與 TBARS反應的物質的量(TBARS)單位表示為mg·MA/kg，試驗重復2次。

1.3.4 FA的測定

用乙酰丙酮法，參照SC/T 3025-2006，水產品中甲醛的測定。將樣品絞碎，稱取10.0 g于500 mL蒸餾瓶中，加入液體石蠟2.5 mL和10%磷酸溶液10 mL，再加蒸餾水至200 mL。連接冷凝裝置，冷凝管下口插入盛有20 mL蒸餾水且置于冰浴的100 mL燒杯中，立即加熱蒸餾，收集蒸餾液80～90 mL，冷卻，移入100 mL容量瓶中，定容，同時做空白蒸餾。分別移取樣品蒸餾液5 mL于10 mL比色管中，加水至10 mL，再加入乙酰丙酮溶液1 mL，混合均勻，置于沸水浴中10 min，取出，冷卻，以空白為參比，于波長415 nm處，以1 cm比色杯進行比色，測定吸光度。每個樣品至少2個平行。

1.3.5 SSP的測定

魷魚用攪拌機絞碎，取5 g裝入打漿袋中，加入100 mL冷卻的0.6 mol/L KCl溶液，然后放入均質機內勻漿2次，4℃條件下提取1.5 h，在4℃條件下以11 000 r/min離心10 min，取上清液作為實驗用鹽溶性蛋白溶液。采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量［7］，用牛血清蛋白做標準曲線，標準曲線為 y=0.005 5x+0.003 6(R2=0.999 3)，計算結果以mg/g表示，試驗重復3次。

1.3.6 肌動球蛋白的提取

魷魚絞碎后取5 g，加入50 mL冷卻的0.6 mol/L KCl(4℃)，勻漿1次，放入4℃冰箱中提取1.5 h，然后離心(5 000 r/min，30 min，0℃)，取 10 mL 上清夜加入30 mL冰冷的去離子水稀釋沉淀肌動球蛋白，離心(5 000 r/min，20 min，0℃)，所得沉淀加入 30 mL冰冷的1.2 mol/L KCl溶液，在0℃攪拌30 min，不溶部分再次離心(5 000 r/min，20 min，0℃)［8］。所得肌動球蛋白溶液用0.6 mol/L KCl調節濃度在4～6 mg/mL。所得溶液備用，以測定活性巰基和Ca2+-ATPase的含量。

1.3.7 活性巰基含量的測定

向1 mL肌動球蛋白中加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)，混合均勻后取4 mL混合溶液，加入0.4 mL 0.1%5，5’二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液，在40℃下反應25 min，溶液在412 nm下測定吸光值。空白用0.6 mol/L KCl溶液代替［8］。計算結果以10-5mol/g表示，試驗重復2次。

1.3.8 Ca2+-ATPase活性的測定

參考萬建榮法［9］以及文獻［10］測定 Ca2+-ATPase活性。酶反應混合液組成如表1。

進行反應時，按表1中混合液組成的配方，在試管中先將除ATP以外的其他成分混合好，將反應混合物放于25℃水浴中，待ATP溶液最后加入時，反應即開始，反應3 min，加入3 mL 15%TCA使反應停止，然后11 000 r/min離心2 min，取離心液4 mL加入試管中，加入3 mL Tris-MgCl2緩沖液(pH 7.5)，搖勻后在加入3 mL定磷試劑(20%Vc∶3mol/L H2SO4∶3%鉬酸銨以等體積混合)，然后在45℃恒溫水浴鍋中反應30 min，在640 nm下測其吸光度。空白組用15%TCA代替。標準曲線用預先在100℃干燥1 h后置于干燥器中干燥冷卻的KH2PO4，配制成0.5 mmol/L的溶液制作，標準曲線為 y=0.919 3x+0.011 1(R2=0.999 8)。計算結果以1 mg酶蛋白在1 min內生成的無機磷酸量μmol表示，即μmol/(min·mg)，試驗重復3次。

表1 Ca2+-ATPase活性測定酶反應混合液組成Table 1 An enzyme reaction mixture for investigating activity of Ca2+-ATPase

1.4 數據處理

實驗數據采用Microsoft Excel 2007進行統計分析。用SPSS 19.0進行方差分析(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 凍藏過程中持水力的變化

魷魚持水力可以用失水率來表示，失水率越高，說明持水力越差，失水率越低，則持水力越強。魷魚在-10、-20、-30和-40℃凍藏過程中失水率的變化如圖1所示。

圖1 魷魚凍藏過程中失水率的變化Fig.1 Rate of water loss changes of squid during frozen storage

從圖1中可以看出，各凍藏溫度下魷魚的失水率與凍藏時間有良好的相關性(r=0.989)，隨著凍藏時間的延長，4組冷凍溫度條件下的失水率均呈上升的趨勢;相同凍藏時間內，溫度越低，失水率越低，各溫度間存在顯著差異性(P＜0.05);凍藏至60d時，-10℃條件下的失水率增加量顯著高于其他3組(P＜0.01)，凍藏至120 d時，-10℃和-20℃的失水率已經很高，只有-40℃仍然保持較低的失水率，其失水率為9.37%，此時-30℃的失水率為14.76%，與-40℃有顯著差異性(P＜0.05)。肉的持水力的實質是肉的蛋白質自身或在加工過程中形成的空間網狀結構，蛋白質分子親水基團的暴露和毛細管力的共同作用，從而以物理方式捕獲的水分量。捕獲水量越多，則持水力越大［11］。凍藏過程中，蛋白質二級結構的有序性明顯降低，由此判斷由于凍藏引起肌動球蛋白(主要是肌球蛋白)的打開與伸展，暴露的非極性氨基酸與鄰近的類似基團引起疏水相互作用，這個過程導致蛋白質的變性和聚集，表現為持水性能下降。蛋白質變性程度取決于冰晶的大小，慢速冷凍會造成大冰晶的形成，以至于蛋白質高度變性，產品持水力降低，凍藏溫度越低，產品中心溫度下降越快，-10℃和-20℃趨向于形成大冰晶，-30℃和-40℃趨向于形成小冰晶，因此凍藏溫度越低，失水率越小，持水力越強。此外，雖然長期冷凍沒有影響肉質的亞顯微結構，但是冰晶的大小會逐漸增加，以至水分丟失［12］。

2.2 凍藏過程中pH值的變化

pH是衡量水產動物宰后品質變化的重要指標［13］。圖2是魷魚在-10、-20、-30和-40℃凍藏條件下的pH值隨時間變化情況。

圖2 魷魚凍藏過程中pH值的變化Fig.2 pH changes of squid during frozen storage

由圖2可見，4組魷魚的初始pH值在6.4左右，且在6.4～7.0之間波動，各溫度之間無顯著差異(P＞0.05);4 組貯藏溫度分別在第 70、105、140、210 天時的pH值為6.77、6.59、6.69和6.72，凍藏60 d后-10、-20、-30和 -40℃的 pH值分別為6.79、6.74、6.66、6.64。以上結果說明，pH 值變化與凍藏時間和凍藏溫度沒有顯著相關性，其原因可能是魷魚在低于-10℃的貯藏條件下，胴體肌球蛋白ATP酶和微生物的活性降低，不能分解產生氨類物質，中和pH，導致pH值的變化不顯著。同時，胴體內大部分游離水在低溫下得到凍結，從而使酶和微生物的活性降低。因此，不同貯藏溫度條件下pH能一直保持在6.4～7.0之間，比較穩定，是與低溫貯藏有關。

2.3 凍藏過程中TBARS的變化

圖3是魷魚分別在-10、-20、-30和-40℃凍藏條件下不同時間的TBARS值的變化情況。由圖3可見，4組魷魚的初始TBARS在0.07 mg MA/kg左右，4 種貯藏條件分別在第 70、105、140、210 天的TBARS 值為0.42、0.20、0.19、0.10 mg MA/kg。在凍藏過程中，-10℃的TBARS增加量明顯高于其他3組(P＜0.01)，且-10℃凍藏下TBARS隨著時間的延長而呈明顯的上升趨勢(r=0.944)，-20℃和-30℃下的TBARS和凍藏時間也有顯著的相關性(r=0.984)，-40℃凍藏210 d后，TBARS僅比初始值增加了 0.03 mg MA/kg，這與 Hui-Hong 等［14］研究結果一致。本次實驗測得最大的 TBARS值在0.4 mg MA/kg左右，國內對TBARS在食品中的限量還沒有規定，國外推薦的TBARS閾值1～2 mg MA/kg。每100 g魷魚鮮品中含蛋白質16%～18%，脂肪1%～2%，因此魷魚的脂肪含量較低，所以在凍藏過程中TBARS值低于一般水產品。凍藏過程中，冰晶的形成使得磷脂質膜的細胞結構遭到破壞，磷脂質減少，釋放出促氧化劑，比如游離鐵，使得底物和酶之間直接接觸［15］。此外貯藏溫度越低，酶活性就越低，導致氧化速率降低，且氧化速率還與凍結速率有關。

圖3 魷魚凍藏過程中TBARS的變化Fig.3 TBARS changes of squid during frozen storage

2.4 凍藏過程中FA的變化

魷魚在-10、-20、-30和-40℃凍藏過程中的FA變化如圖4所示。圖4可見，4組魷魚的FA隨著凍藏時間的延長都顯著增加(r=0.982)，其中-10℃和-20℃在前15 d甲醛含量由2 mg/kg左右快速上升到4 mg/kg左右，-30℃和-40℃在前30 d甲醛含量由2 mg/kg左右快速上升到4 mg/kg左右，隨后，甲醛含量仍然呈上升趨勢，不過上升速度減緩;相同凍藏時間內，-10℃甲醛含量最高，然后是-20、-30、-40℃最低。凍藏過程中TMA在TMAO酶的作用下會產生DMA和FA，TMAO降解的速率和多種因素有關，比如貯藏溫度、物種、肌肉特性和還原條件，在魚體捕獲后前6周，氧化三甲胺酶活性一直上升，到第6周時達到最高，隨后氧化三甲胺酶活性開始下降，到24周降到最低［15］。-10℃的貯藏溫度相對于其他3個實驗溫度，氧化三甲胺酶的活性可能較高，導致最終甲醛的含量較高。貯藏溫度越低，氧化三甲胺酶的活性越低，甲醛含量越低。Leelapongwattana等［16］研究發現，狗母魚貯藏在-20℃時，隨著凍藏時間的延長FA呈上升趨勢，且真空處理要比空氣處理上升的快，發現氧與TMAO酶發生抑制作用;他發現當TMA降解產生等摩爾的DMA和FA后，實際測得的FA含量小于DMA，說明FA和蛋白質側鏈的不同官能基團發生反應，隨后形成分子內和分子間的亞甲基橋，這加劇了凍藏時蛋白質變性，一旦FA和蛋白質結合，蛋白質二級結構就會伸展，發生聚集，并且聚集物不斷增加，導致了蛋白質溶解度的下降。

圖4 魷魚凍藏過程中FA的變化Fig.4 FA changes of squid during frozen storage

2.5 凍藏過程中鹽溶性蛋白含量的變化

目前，國內對于水產品類蛋白冷凍變性的研究，常常是通過測定魚肉中的Ca2+-ATPase活性、鹽溶性蛋白含量、以及巰基數量等指標，來分析淡水魚蛋白質冷凍變性的程度。魷魚在-10、-20、-30和-40℃凍藏過程中鹽溶性蛋白的含量變化如圖5所示。從圖5中可以看出，4組鹽溶性蛋白含量初始值為44.51 mg/g，隨著凍藏時間的延長，4組魷魚中鹽溶性蛋白含量均呈下降趨勢(r=0.929)，4種貯藏條件分別在第70、105、140、210天時鹽溶性蛋白含量分別為15.50、16.44、16.69、22.44 mg/g，相同凍藏時間內，-10℃的鹽溶性蛋白含量下降最多，依次為-20、-30、-40℃，各溫度之間存在顯著性差異(P＜0.05);凍藏至60 d時，-10℃的鹽溶性蛋白減少量顯著高于其他3組(P＜0.01)，凍藏至120 d時，-30、-40℃鹽溶性蛋白含量分別為21.42、26.00 mg/g。這和2.1試驗結果中凍藏引起魷魚持水力降低的現象相關。鹽溶性蛋白是魚肉中重要的功能性蛋白，-10℃的鹽溶性蛋白減少量顯著高于其他3組，導致魷魚持水力顯著低于其他3組。-30、-40℃的儲藏條件，由于溫差較大，冷凍速凍較快，肌肉中形成的冰晶較小，對蛋白網絡的機械破壞作用小，因而，鹽溶性蛋白的含量相對較多。凍藏引起魚肉肌動球蛋白(主要是肌球蛋白)的打開與伸展，暴露的非極性氨基酸與鄰近的類似基團引起疏水相互作用，這個過程導致了蛋白質的變性［17］。在凍藏過程中，巰基氧化形成的二硫鍵會導致肌球蛋白重鏈的聚合，從而降低其鹽溶性。蛋白質的部分結合水形成冰晶而析出，導致肌動球蛋白分子之間相互形成非共價鍵，進而形成超大分子的不溶性凝聚體使肌動球蛋白溶出量下降。另外肌動球蛋白變性后，會產生一種在高離子強度下不溶解但在堿液中可以溶解的蛋白質，即堿溶性蛋白質，也會導致肌動球蛋白在凍藏過程中溶解度的下降。

圖5 魷魚凍藏過程中鹽溶性蛋白的變化Fig.5 Salt soluble protein content changes of squid during frozen storage

2.6 凍藏過程中活性巰基含量的變化

圖6表示了魷魚在-10、-20、-30和-40℃凍藏過程中活性巰基的含量變化。由圖6可知，隨著凍藏時間的延長，4組魷魚中活性巰基含量均呈顯著下降趨勢(r=0.952)，4組活性巰基含量初始值為22.97×10-5mol/L，在凍藏初期活性巰基含量快速下降，凍藏至60 d時，4組活性巰基含量分別為5.99×10-5、8.37 × 10-5、14.81 × 10-5、17.10 × 10-5mol/L，同一時間不同貯藏溫度，魷魚巰基含量差異顯著，特別是15 d后，-30℃和-40℃貯藏的魷魚巰基含量顯著高于其他2組。魷魚凍藏過程中活性巰基含量下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纖維蛋白空間結構發生改變，使埋藏在分子內部的疏基活性基團(巰基SH1)暴露出來，易于發生巰基氧化和二硫化物的置換，導致活性巰基含量減少［16］。活性巰基的減少意味著分子間或分子內的二硫鍵的形成，氫鍵和疏水鍵的形成掩蓋了在肌動球蛋白分子內的活性巰基。此外，FA的大量形成導致了蛋白聚集增加，從而加劇了巰基的氧化。-30℃和-40℃相對于其他2組的貯藏條件，形成的冰晶較小，對蛋白質空間結構破壞較小，對活性巰基的保護較好。說明-10℃和-20℃不能很好的保持魷魚品質，-30℃和-40℃為較好的溫度。

圖6 魷魚凍藏過程中活性巰基含量的變化Fig.6 Activesulfydryl content changes of squid during frozen storage

2.7 凍藏過程中Ca2+-ATPase活性的變化

冷凍儲藏會導致蛋白質變性，ATPase活性部位也會發生變化，所以，測定肌動球蛋白Ca2+-ATPase活性被廣泛用來作為判定魚肉凍藏品質變化的指標。圖7表示了魷魚在-10、-20、-30和-40℃凍藏過程中的Ca2+-ATPase活性變化。從圖7中可以看出，4組魷魚Ca2+-ATPase活性初始值為12.71×10-2μmol/min·mg，隨著凍藏時間的延長，4組的Ca2+-ATPase活性均呈下降趨勢(r=0.968)，且溫度越低，下降程度越小。凍藏至60 d時，-10℃的Ca2+-ATPase活性減少量顯著高于其他3組(P＜0.01)，凍藏至120 d時，-10℃和-20℃的Ca2+-ATPase活性已經很低，此時-30℃和-40℃的Ca2+-ATPase活性分別為 5.47 ×10-2、7.74 ×10-2μmol/min·mg。引起凍藏過程中魚肉肌原纖維蛋白質Ca2+-ATPase活性下降的原因目前有以下幾種:Lian等認為是由于冰晶的機械作用引起的，也有很多研究者認為是由pH值下降引起的，還有許多的研究認為，ATPase活性下降的主要原因是由于巰基氧化形成二硫鍵導致分子聚合，通過前文對pH的研究，作者認為ATPase活性下降是由冰晶機械作用及巰基氧化作用引起的。這和鹽溶性蛋白含量，巰基含量及持水力降低趨勢相關，冷凍對蛋白質空間網絡的機械破壞，降低了肌球蛋白的酶活力，導致蛋白質變性，功能性鹽溶性蛋白含量及巰基含量減少，從而使蛋白質的持水力降低。凍藏的溫度越低，冰晶對蛋白質的機械破壞越小，蛋白質變性程度越低，鹽溶性蛋白和活性巰基的含量相對較高，Ca2+-ATPase的活性也較高。ATPase活性與肌球蛋白的球狀頭部基團有關，ATPase活性的下降意味著肌球蛋白的構象的變化，特別是頭部部位，以及蛋白質聚集;蛋白質分子間的重新排列也會導致ATPase活性的下降;FA作為有效的交聯劑，通過亞甲基橋使蛋白質聚集，特別是肌球蛋白的頭部部位［18］。

圖7 魷魚凍藏過程中Ca2+-ATPase活性的變化Fig.7 Ca2+-ATPase activity changes of squid during frozen storage

3 結論

魷魚在4組不同凍藏溫度條件下，魷魚的pH值在6.4～7.0之間，各溫度之間無顯著差異(P＞0.05)，低于-10℃的凍藏溫度，魷魚的pH不隨溫度的變化而顯著變化。因此，pH值不能作為評價魷魚品質變化的指標。

4組凍藏溫度條件下，魷魚的鹽溶性蛋白含量、活性巰基含量和Ca2+-ATPase活性都隨凍藏時間的延長而顯著降低，凍藏的溫度越低，冷凍對上述有關的蛋白質指標影響越小，鹽溶性蛋白、活性巰基含量和Ca2+-ATPase活性顯著提高，從而，魷魚的失水率降低，魷魚的品質越好。同時，魷魚的 FA含量和TBARS值也降低。從這一點看，本文研究的結果說明，-30℃和-40℃的凍藏條件對魷魚品質的保護要顯著優于-10℃和-20℃，結合凍藏的經濟性及儲藏時間，本研究建議，采用-30℃的凍藏溫度對魷魚的保存比較合適。

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