低強度微波處理對獼猴桃細胞壁降解酶活性的影響

李明霞，韓建群，王琦，何雨婷，郭艷明，董明，2

1(安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥，230036)

2(合肥市農產品加工研究院，安徽 合肥，230036)

獼猴桃(Actinidia chinensis)屬于獼猴桃科獼猴桃屬多年生落葉藤本植物，果肉質地細嫩，氣味清香，酸甜可口，且具有很高的營養價值和藥用價值。近年來，獼猴桃產量逐年提高，但是獼猴桃果實不耐貯運，易于軟化腐爛，從而制約市場的銷售和生產發展。果肉軟化是獼猴桃成熟衰老的主要特征之一，防止果實軟化可延長水果的壽命和貨架期。獼猴桃果實軟化的原因是細胞壁內部結構的破壞，通過細胞壁物質的降解作用引起［1-2］，與細胞壁降解有關的酶主要是多聚半乳糖醛酸酶［3-5］、果膠甲酯酶［6-7］、纖維素酶［8］和β-半乳糖苷酶［9］等。

近年來，微波在食品加工方面的應用，主要是利用微波激發水分子的運動產生的熱效應來體現的，可用于食品加熱或殺菌［10］，同時微波存在的非熱效應未能引起足夠的重視，相關研究甚少。微波的非熱效應是指微波作用對溫度沒有明顯變化的情況下，對生物體產生的影響。有研究表明，弱微波照射可使生物體的理化性質，功能特性發生變化［11］，使其生理活性物質發生變異而喪失活力或死亡［12］。同時，微波的電場會使細胞的膜功能發生變異，從而使細胞的正常代謝功能及生理功能受到相應的破壞，這樣可以使微生物的生長受到抑制或死亡［13］，進而使細胞的DNA和RNA分子結構發生變化，但是微波的非熱生物效應在果蔬保鮮方面研究報道甚少，目前僅有戴美娟等［14］、費莉娟等［15］對獼猴桃、草莓開展微波保鮮的相關研究報道。

本試驗通過研究低強度微波處理獼猴桃果實在其貯存過程中的細胞壁降解相關酶——多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲酯酶(PME)、纖維酶(Cx)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性的變化，結合果實品質指標分析，初步探討了低強度微波對獼猴桃果實軟化和保鮮的影響，為進一步開發安全、簡便、快捷的果實貯藏保鮮新技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品處理

1.1.1 試驗材料

供試獼猴桃品種為安徽農業大學選育的“皖翠”獼猴桃果實，于2014年10月20日采自安徽省霍邱縣皖西獼猴桃研究所。采收當日運回農產品加工與貯藏實驗室，在0～1℃的冷庫預冷10 h左右。挑選表面保持完好，無機械損傷，無病蟲害，無腐爛，大小、成熟度一致的獼猴桃果實作為樣品。

1.1.2 樣品處理

將預冷獼猴桃分11組進行微波連續照射處理，微波輸出功率為32.5 W 時，設置 3、5、7、9、11 min;65 W時設置2、3、4、5、6 min，另設對照 1 組。每組微波處理前后實測果心溫度，處理后在常溫下放置2 h后，用PE保鮮袋包裝裝箱，轉入0～1℃的冷庫中貯藏，每15天隨機取樣1次進行各項指標的測定，重復3次。

1.2 儀器與設備

SAM-255型微波系統，美國CEM公司;LR20-A高速冷凍離心機，北京雷勃爾冷凍離心機有限公司;PHB-4雷磁牌數字型pH計，上海精密雷磁公司;UV-5800PC型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司;GY-4數顯臺式水果硬度計，浙江托普儀器有限公司。

1.3 指標測定

1.3.1 品質指標的測定

可溶性糖含量采用硫酸蒽酮試劑法;可滴定酸含量采用酸堿滴定法;Vc含量的測定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法。

1.3.2 果肉硬度的測定

用GY-4數顯式水果硬度計測定其果實的硬度，每個處理隨機取8個果實，單個果實從不同的部位測4次，測定時削去果皮的面積為1 cm2，取平均值。

1.3.3 細胞壁酶活性的測定

酶液的提取參考 Lohani等［16］和 Deng 等［17］的方法進行相應改進，取果肉組織4 g，樣品放于冷凍過的研缽，將研缽放于碎冰上，加入40 mL，50 mmol/L pH 7的 Tris-HCl緩沖液(含有 20 mol/L NaCl、10 mmol/L EDTA和5 g/L PVPP)，冰浴上研磨勻漿，然后再低溫4℃ 12 000×g離心30 min，上清液即為粗酶提取液，置于4℃冰箱保存備用。PG和Cx活性的測定用DNS比色法，PME活性測定采用NaOH滴定法［18］，β-Gal活性的測定使用 Na2CO3法。

1.4 數據的統計與分析

采用Excel軟件進行數據統計，所有數據均為3次重復試驗的平均值。采用SPSS軟件中的LSD法和Duncan法進行相關指標的差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 低強度微波處理后獼猴桃果實的溫度變化趨勢

低強度的微波也就是利用微波的非熱效應，通過溫度和功率的強度變化來作用于物體，其果實溫度沒有明顯的變化，或者是溫度處于亞致死的情況下，溫度控制在20℃以下，這樣既可以產生很強的生物反應，可以使果蔬的理化性質，功能特性發生變化，也可以使其生理活性物質發生變異而喪失活力或死亡。如圖1顯示的是經過低強度的微波處理后獼猴桃果實的果實溫度變化趨勢，隨著功率和時間的增加溫度呈上升趨勢。

圖1 低強度微波處理皖翠獼猴桃的溫度變化趨勢Fig.1 Changing temperature trend of low intensity microwave treatments of“Wancui”kiwifruit

2.2 低功率微波處理對獼猴桃品質的影響

2.2.1 對獼猴桃可溶性糖含量的影響

可溶性糖主要是指能溶于水的葡萄糖、果糖和蔗糖這3種糖，隨著果實的成熟，其含量在不斷地增加，在果實成熟過程中主要是通過果糖來表現，且果糖的甜度主要也是通過果糖來體現的。由表1可知，獼猴桃果實在貯藏過程中，可溶性糖呈上升趨勢，貯藏45 d時，每個處理組在不同的階段表現出了顯著差異(P＜0.05)，僅有少數差異不顯著(P＞0.05)，例如65 W/3 min和32.5 W/7 min;32.5 W/3 min和32.5 W/11 min，且可以看出，適當的微波處理，如用32.5 W/5 min和65 W/3 min可以抑制可溶性糖的上升，增加果實的品質，提高的果實的實用價值和經濟效益。

表1 低功率微波處理對獼猴桃可溶性糖含量的影響/%Table 1 Effect of low-power microwave treatment soluble sugar content of kiwifruit

2.2.2 對獼猴桃可滴定酸含量的影響

可滴定酸含量的多少對于獼猴桃的口感、風味、pH值及貯藏性都有很大影響。如表2所示，獼猴桃的可滴定酸含量變化大體趨勢一致，都隨著貯藏時間的增加而不斷減少。從貯藏開始到最后，經過不同的處理后果實的可滴定酸含量有著不同的變化，部分微波處理促進了可滴定酸含量的下降，且處理間與對照差異不顯著(P＞0.05)例如，貯藏30 d時，對照組與32.5 W/3 min和32.5 W/11min差異不顯著，但是有些處理與對照存在明顯的差異(P＜0.05)，尤其是用32.5 W/5 min、65 W/3 min、32.5 W/7 min 和65 W/4 min處理的果實與對照組存在顯著差異。由此可見，適當的低功率微波處理獼猴桃能夠抑制可滴定酸含量的下降，提高其果實的品質下降。

表2 低功率微波處理對獼猴桃可滴定酸含量的影響/%Table 2 Effect of low-power microwave treatment titratable acid content of kiwifruit

2.2.3 對獼猴桃Vc含量的影響

獼猴桃果實具有較高的Vc，且果實本身在發育早期就含一定的Vc，在脫離母體后的綠熟期，Vc的合成仍會少量地進行，但由于呼吸作用消耗使得有機物逐漸減少，合成Vc的底物不足，以及Vc的不穩定性，容易分解，使果實的Vc含量在貯藏過程中逐漸減少。由表3可知，獼猴桃果實的Vc含量呈逐漸降低趨勢，但是15 d時，明顯呈上升趨勢。經過不同的處理后，不同的處理在每個階段都有明顯的差異(P＜0.05)，32.5 W/5 min和65 W/3 min處理的果實與對照顯著差異(P＜0.05)，因此恰當的低功率微波可以抑制Vc含量的降解，控制水果的營養價值不被損失，延長了其水果品質。

表3 低功率微波處理對獼猴桃Vc含量的影響 單位:mg/100gTable 3 Effect of low-power microwave treatment Vc content of kiwifruit

2.2.4 對獼猴桃硬度的影響

硬度是指果實抗壓力的強弱，也是衡量果實品質的重要指標，也是果實軟化的直觀表現。從表4可知，獼猴桃果實的硬度隨貯藏時間的延長呈下降趨勢，貯藏前60 d果實下降速度緩慢，下降范圍為2～3.5 N，其每個階段差異顯著(P＜0.05)，但有些處理差異不顯著(P＞0.05)，例如15d時32.5 W/3 min和32.5 W/9 min;65 W/3 min和65 W/4 min等，但在貯藏后期，獼猴桃果實的硬度急速下降，尤其在75 d時，每個處理組差異極顯著(P＜0.05)，其硬度下降速度由慢到快的順序依次為32.5 W/5 min＜65 W/3 min＜32.5 W/7 min＜65 W/2 min＜65 W/4 min＜65 W/5 min＜32.5 W/9 min＜32.5 W/11 min＜32.5 W/3 min＜對照組＜65 W/6 min，說明在皖翠獼猴桃在貯藏過程中，適當的溫度和時間組合的微波的非熱效應可以減緩果實硬度下降的速度，尤其是用32.5 W/5 min和65 W/3 min處理的果實與對照顯著差異(P＜0.05)，對其硬度的保護作用更加明顯，明顯可以抑制果實的軟化。

表4 低功率微波處理對獼猴桃硬度的影響 單位:kg/cm2Table 4 Effect of low-power microwave treatment firmness of kiwifruit

2.3 低功率微波處理對獼猴桃多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的影響

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG，EC，3.1.1.15)是一類重要的水解酶，一度被認為是控制果實軟化的關鍵酶，其主要功能是水解果實細胞壁中果膠酸的α-(1→4)-D-半乳糖苷酶，生成一些低聚的半乳糖醛酸或半乳糖醛酸，導致細胞壁解體，最終果實軟化［19-20］。由表5可知，獼猴桃果實在貯藏過程中呈先下降后上升的趨勢，貯藏0～15 d時，果實的PG酶活性下降，15 d以后，獼猴桃果實隨著果實的硬度逐漸下降，其PG的活性呈現緩慢上升的趨勢，直到貯藏值第75天時，PG活性上升的范圍為425.35～767.23 μg/(g·min)，且在這個貯藏時間，各處理間的差異性相當顯著(P＜0.05)，且PG活性上升速度由慢到快為32.5 W/5 min＜65 W/3 min＜65 W/2 min＜32.5W/7 min＜32.5W/11 min＜65 W/5 min＜65 W/4 min＜32.5 W/9 min＜65W/6 min＜對照組＜32.5 W/3 min，說明在皖翠獼猴桃貯藏過程中，適當低強度的微波可以抑制PG酶活性的上升，根據分析，尤其是32.5 W/5 min和65 W/3 min處理的獼猴桃果實，可以維持獼猴桃果實的PG活性相對于對照低，降低細胞壁的破損，從而抑制了果實軟化的速度。

表5 低功率微波處理對獼猴桃多聚半乳糖醛酸酶活性的影響 單位:μg/(g·min)Table 5 Effect of low-power microwave treatment polygalacturonase activity of kiwifruit

2.4 低功率微波處理對獼猴桃果膠甲酯酶(PME)活性的影響

果膠甲酯酶(Pectinmethylesterase，PME，EC.3.1.1.11)廣泛存在于許多高等植物組織中，參與細胞壁果膠物質的脫甲基化，在果膠甲酯酶的作用下，高分子質量果膠中的半乳糖醛酸殘基的C6移除，留下了大量的自由的羧基群，細胞壁的pH值改變，通過鈣離子連接成凝膠結構，使多聚糖更容易被PG降解。此外，PME能從細胞壁的果膠中去除甲基基團，從而加速了細胞壁的降解，而PME的脫甲基產物又是PG作用的基質，因此，PME的作用可能是加速果實的成熟軟化。從表6可以看出，果膠甲酯酶的活性為先下降后上升的趨勢，其中部分微波處理的果實的果膠甲酯酶活性明顯上升速度緩慢，貯藏15 d之前，酶活性緩慢下降，15 d～75 d時呈緩慢上升，75 d后酶活性急劇上升，加快了果實軟化的速度，但是在75 d時，每組處理間差異性相當顯著(P＜0.05)，且各處理間酶活性上升的速度由慢到快依次為65 W/3 min＜32.5 W/5 min＜65 W/4 min＜32.5 W/7 min＜32.5 W/3 min＜65 W/2 min＜32.5 W/9 min＜對照組＜65 W/6 min＜32.5 W/11 min＜65 W/5 min，說明微波的非熱效應對獼猴桃果實貯藏有一定的抑制作用，可以抑制PME活性的上升，延緩果實的軟化，提高了果實的貨架期。

表6 低功率微波處理對獼猴桃果膠甲酯酶活性的影響Table 6 Effect of low-power microwave treatment pectinmethylesterase activity of kiwifruit

2.5 低功率微波處理對獼猴桃纖維素酶(Cx)活性的影響

纖維素酶(Cellulase，Cx，EC3.2.1.4)作為細胞壁的骨架物質，在細胞壁降解過程中起了非常重要作用的一種細胞壁酶。它的主要功能是分解含1，4-β-葡萄糖基鏈的半纖維素的多糖，在不同的組織中，它們針對不同的多糖底物起作用。從表7可以看出，0～15 d果實的纖維素酶急劇下降，抑制了果實細胞壁的降解，15 d后，酶活性呈現上升趨勢，但在75 d時每組處理果實的酶活性之間存在著明顯的差異(P＜0.05)，其酶活性由慢到快的變為32.5 W/5 min＜32.5 W/7 min＜65 W/3 min＜65 W/2 min＜32.5 W/3 min＜32.5 W/9 min＜對照組＜65 W/4 min＜32.5 W/11 min＜65 W/5 min＜65 W/6 min，根據其酶活性變化程度可知，適當的微波時間和功率的組合，在一定程度上抑制了細胞壁的降解，降低了果實軟化的速度。

表7 低功率微波處理對獼猴桃纖維素酶活性的影響 單位:μg/(g·min)Table 7 Effect of low-power microwave treatment cellulase activity of kiwifruit

2.6 低功率微波處理對獼猴桃 β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性的影響

β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，β-Gal，)也作為一種細胞壁降解相關的酶，它可以使細胞壁的一些組分變得不穩定，主要作用于鼠李半乳聚糖骨架的支鏈殘基，降解果膠聚合體，破壞細胞壁結構，從而使果實軟化［21］。從表8可知，β-Gal活性呈現先下降后上升趨勢，0～15 d酶活性急劇下降，15～30 d時急劇上升，30 d之后，酶活性呈緩慢上升趨勢，在75 d時，32.5 W/5 min和32.5 W/7 min;65 W/2 min和65 W/6 min;32.5 W/3 min和65 W/5 min差異性不顯著(P＞0.05)，與其他處理組之間差異性顯著(P＜0.05)，其酶活性變化的程度由慢到快的趨勢為65 W/3 min＜(32.5 W/5 min和32.5 W/7 min)＜65 W/4 min＜(65 W/2 min和65 W/6 min)＜(32.5 W/3 min和32.5 W/5 min)＜32.5 W/11 min＜32.5 W/9 min＜對照組，因此適當的微波的非熱效應對果實酶活性的上升有一定的抑制作用，防止了果實的軟化，從而延長其貨架期。

表8 低功率微波處理對獼猴桃β-半乳糖苷酶活性的影響 單位:μg/(g·min)Table 8 Effect of low-power microwave treatment β-Galactosidase activity of kiwifruit

3 討論與結論

果實軟化是果實成熟的重要特征之一，果肉的軟化與果實的硬度以及細胞壁降解的酶有密切的關系。因果實在貯藏過程中，隨果實的軟化，果實的硬度下降，Vc含量隨著果實的成熟降解，滴定酸含量下降，可溶性糖會上升，細胞壁降解酶活性發生變化與硬度呈現負相關。研究結果表明，32.5 W/5 min和65 W/3 min的低強度微波功率和時間選擇，對果實的軟化有很好的保護作用，由此說明，只有恰當的功率和時間的變化才會很好地抑制細胞壁的降解，保證果實的品質不會下降，延長其果實的貨架期，提高了果實的營養價值。果實貯存75 d之前，果實的硬度緩慢下降，變化幅度比較小，PG和PME活性呈現先下降后上升的趨勢，且PG和PME活性上升的速度是果實的硬度下降的區域，表現出PG活性和PME與果實硬度呈明顯的負相關。周培根等［22］的研究結果也表明，隨著桃果實的成熟，PG活性呈上升趨勢，果實的硬度下降;陸勝明等［23］的研究結果證明，PME在青梅果實的軟化中發揮著重大的作用。Cx和β-Gal活性呈現出先急劇下降后上升的趨勢，其變化程度也和果實硬度的下降呈負相關。前人已經在蘋果、番木瓜、青梅等果實方面進行了研究，結果表明果實的硬度下降與 Cx和 β-Gal活性有密切的關系。因此，32.5 W/5 min和65 W/3 min微波功率與時間的組合可以對皖翠獼猴桃果實軟化有抑制作用，延緩了果實的可溶性糖含量的上升和果實硬度、可滴定酸含量和Vc含量的下降，抑制了細胞壁酶降解的速度，保持了果實的商品價值。有關微波處理對果實細胞壁降解酶的機理已從分子方面進行深入研究。

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