丙酮丁醇發(fā)酵過(guò)程關(guān)鍵酶活性研究*

王風(fēng)芹，張瑞，謝瑤嬛，謝慧，宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州，450002)

在當(dāng)下全球能源危機(jī)、石化燃料供應(yīng)不足、急需提高能源安全與多元化的背景下，丁醇作為一種極具競(jìng)爭(zhēng)力的可再生生物燃料，快速引起了公眾與科學(xué)界的高度重視［1］。丁醇的4-C結(jié)構(gòu)使其比乙醇具有更高的辛烷值和熱值［2］，可以有效提供更強(qiáng)勁的動(dòng)力。丁醇還具有良好的抗爆性、安全性、融合性，被認(rèn)為是最具有代替石化燃料潛在能力的新型燃料［3］。

丁醇發(fā)酵是利用梭狀芽胞桿菌屬微生物及其基因突變菌株在專(zhuān)性厭氧環(huán)境下，以淀粉、糖蜜、木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解產(chǎn)物、甘油、藻類(lèi)生物質(zhì)以及無(wú)機(jī)物作為基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)［1，4］。丁醇嚴(yán)格厭氧發(fā)酵存在菌株對(duì)氧氣敏感、菌體生長(zhǎng)代謝緩慢、發(fā)酵工藝苛刻且繁瑣等不利因素，所以尋找新的可以在兼性厭氧條件下進(jìn)行丁醇發(fā)酵的微生物菌株成為促進(jìn)丁醇發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化的有效途徑之一。本課題組從種植懷地黃的土壤中分離篩選到1株可以產(chǎn)丁醇的兼性厭氧芽孢桿菌(Bacillus sp.)C2菌株，其代謝產(chǎn)物主要包括丙酮、乙醇和丁醇，還有少量的甲酸、乙酸和丁酸。研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus sp.C2可以在微氧環(huán)境下有效利用葡萄糖、淀粉和木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁醇。本文對(duì)比研究了Bacillus sp.C2在嚴(yán)格厭氧和兼性厭氧條件下的丙酮丁醇發(fā)酵情況，并對(duì)兩種發(fā)酵條件下代謝途徑中關(guān)鍵酶活性變化進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:Bacillus sp.C2由本課題組從種植懷地黃土壤中分離、純化得到，于-80℃甘油管中保存;酶活性測(cè)定所需試劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基與緩沖液

活化培養(yǎng)基(5%玉米醪):100 mL水中加入5 g玉米粉調(diào)至呈糊狀，煮沸加熱5～8 min，并不斷攪拌，將制成的糊狀玉米醪液倒入試管中(9 mL/支)，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(P2半合成培養(yǎng)基)(g/L):葡萄糖50.0，酵母提取物1.0，115℃滅菌20 min，冷卻后加入10 mL/L經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾的貯備溶液。貯備溶液(g/L):KH2PO450.0，K2HPO450.0，乙酸銨220.0;對(duì)氨基苯甲酸 0.1，VB10.1，VH0.001;MgSO4·7H2O 20.0，MnSO4·H2O 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0，NaCl 1.0［8］。

TE 25Suc緩沖液(L):102.7 g蔗糖，25mL 1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，50mL 0.5 mol/L EDTA，NaOH調(diào)pH 8.0后定容至1 L待用。

1.3 丙酮丁醇發(fā)酵

1.3.1 菌種活化

以體積比為10%的接種量，將菌種接種到5% 的已滅菌玉米醪液體培養(yǎng)基試管中，在100℃沸水中熱激80 s后迅速放入涼水冷卻，37℃靜置培養(yǎng)48 h。

種子液制備:將已經(jīng)充分活化后的菌種以體積比10%的接種量接種到300 mL三角瓶(含有200 mL P2培養(yǎng)基)中，放入普通恒溫培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)24 h。

丁醇發(fā)酵:將制備好的種子液以體積比10% 的接種量接種到滅菌后的300 mL三角瓶/血清瓶(裝液量為270 mL，血清瓶中N2吹掃液面2 min去除氧氣后滅菌)中，恒溫培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)，每隔12 h取樣1次至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 生物量、pH、溶解氧及溶劑的測(cè)定

菌體生物量:使用UV-722S分光光度計(jì)在600 nm處檢測(cè)其吸光值(OD);發(fā)酵液的pH值:PHS-4C酸度計(jì)室溫下測(cè)定;發(fā)酵液中溶解氧:重鉻酸鉀-三氯化鈦方法測(cè)定［9］。發(fā)酵產(chǎn)物乙醇、丙酮和丁醇利用Agilent 7890A氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱 HPFFAP(30 m × 0.32 mm × 1 μm);檢測(cè)器 FID(250℃);進(jìn)樣量0.2 μL，進(jìn)樣器溫度200℃;載氣N21.5 mL/min，H230 mL/min，空氣 350 mL/min。葡萄糖和有機(jī)酸利用Dionex P680高效液相色譜儀，離子排斥色譜柱Aminex HPX-87H，示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相0.005 mol/L H2SO4(pH2.0)，流速0.6 mL/min，柱溫55℃。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取

取樣發(fā)酵液2 mL，4℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液;0.1mol/L Tris-HCl緩沖液清洗菌體2～3次，離心條件如上述;之后加入200 μL TE 25Suc緩沖液將菌體懸浮(緩沖液中菌OD600值＞1.5)，加入50 μL溶菌酶緩沖液(10 mg/mL);放入37℃水浴中進(jìn)行細(xì)胞破碎12～24 h，12 h后補(bǔ)加50 μL溶菌酶液;最后4℃、8 000 r/min離心10 min，上清液即為酶粗提液。利用核酸蛋白檢測(cè)儀(Thermo Scientific，Nanoprop1000)測(cè)定蛋白含量。

1.3.4 酶活性檢測(cè)

前期研究發(fā)現(xiàn)，Bacillussp.C2具有類(lèi)似丙酮丁醇梭菌的丁醇代謝途徑［10］，因此研究了Bacillus sp.C2丁醇發(fā)酵過(guò)程中6種關(guān)鍵酶酶活性變化情況。包括乙醇脫氫酶(ethanol dehydrogenase)利用依賴(lài)NAD+/NADH將乙醛還原為乙醇的活性進(jìn)行檢測(cè)［11］;丁醛脫氫酶(butylaldehyde dehydrogenase)，依據(jù)丁酰輔酶A還原為丁醛反應(yīng)中NAD+的還原活性檢測(cè)和丁醇脫氫酶(butanol dehydrogenase)，依據(jù)丁醛還原為丁醇反應(yīng)中NADP+(NAD+)的還原活性檢測(cè)［12］;乙酸激酶(acetate kinase，AK)，利用酶串聯(lián)分析法檢測(cè)ADP和異羥肟酸的形成，隨后進(jìn)行 Fe3+著色反應(yīng)來(lái)檢測(cè) AK 酶活性［13］;丁酸激酶(butyrate kinase，BK)，利用丁酰磷酸和ATP在過(guò)量的羥胺環(huán)境中可以合成羥肟酸，然后用 Fe3+著色可以形成脫氫酶混合體來(lái)檢測(cè)BK活性［14］;乙酰乙酰輔酶A:乙酸/丁酸:輔酶A轉(zhuǎn)移酶(acetoacetyl-CoA transferase，ACT)，利用在ε310處檢測(cè)乙酰乙酰輔酶 A底物消失變化來(lái)測(cè)定CoA-T 活性［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus sp.C2不同溶氧環(huán)境下生物量及pH值變化

Bacillus sp.C2在嚴(yán)格厭氧和兼性厭氧培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及pH值的變化見(jiàn)圖1。在三角瓶中進(jìn)行兼性厭氧(facultative anaerobic，F(xiàn)A)發(fā)酵，其發(fā)酵液溶氧濃度(desovled oxygen，DO)由最初的4.6 mg/L降低到0.64 mg/L;血清瓶中進(jìn)行嚴(yán)格厭氧(strictly anaerobic，SA)發(fā)酵，其發(fā)酵液DO含量從1.44 mg/L下降到0.24 mg/L。發(fā)酵前期(0～24 h)，嚴(yán)格厭氧條件下菌體生長(zhǎng)速率略高于兼性厭氧條件，然而兼性厭氧條件下發(fā)酵液OD600最大值為2.945高于嚴(yán)格厭氧條件下的2.793。發(fā)酵前期(0～24 h)，專(zhuān)性厭氧條件下發(fā)酵液pH值下降速率顯著高于兼性厭氧，發(fā)酵36 h后pH緩慢回升。

圖1 不同條件下培養(yǎng)基中pH值、生物量及溶解氧變化Fig.1 Changes of biomass，pH value and dissolved oxygenin different condition medium

2.2 Bacillus sp.C2發(fā)酵結(jié)果

Bacillus sp.C2在兼性厭氧與專(zhuān)性厭氧條件下葡萄糖利用速率及產(chǎn)溶劑和有機(jī)酸結(jié)果如圖2所示。葡萄糖初始濃度為47.3 g/L，發(fā)酵84 h之后葡萄糖完全利用，發(fā)酵前期(72 h)專(zhuān)性厭氧條件下葡萄糖利用速率高于兼性厭氧，而發(fā)酵后期兼性厭氧葡萄糖利用速率高于專(zhuān)性厭氧。發(fā)酵96 h總?cè)軇┊a(chǎn)生進(jìn)入穩(wěn)定期，丁醇、丙酮、乙醇在兼性厭氧和嚴(yán)格厭氧條件下最高產(chǎn)量分別為 9.50、2.63、0.89 g/L 和8.52、2.48、0.74 g/L，其丁醇得率分別為0.201和0.180 g/g。丁醇產(chǎn)量在兼性厭氧比嚴(yán)格厭氧條件下高11.50%，總?cè)軇┊a(chǎn)量高9.01%(圖2A，2B)。

圖2 兼性厭氧(A，C)和專(zhuān)性厭氧(B，D)條件下溶劑、酸的產(chǎn)量及葡萄糖質(zhì)量濃度Fig.2 Concentration of butanol，acetone，ethanol，acids and glucose consumed under facultative anaerobic(A，C)and strictly anaerobic(B，D)condition

乙酸、丁酸作為丁醇代謝途徑中的重要中間產(chǎn)物，對(duì)丁醇的產(chǎn)生有巨大的影響。Clostridium acetobutylicum丁醇發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)酸階段未解離酸類(lèi)物質(zhì)累積過(guò)快將導(dǎo)致發(fā)生“Acid Crash”現(xiàn)象，其中甲酸是引起該現(xiàn)象最主要的原因［16-17］。Bacillus sp.C2在兼性厭氧和嚴(yán)格厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生酸類(lèi)物質(zhì)的變化情況如圖(2C、2D)。兼性厭氧發(fā)酵時(shí)甲酸、乙酸、丁酸在0～12 h階段急劇增加，最大值分別為0.288、2.398和2.295 g/L;之后由產(chǎn)酸階段轉(zhuǎn)入產(chǎn)溶劑階段，甲酸、丁酸含量逐漸下降，乙酸含量維持2.4 g/L左右。嚴(yán)格厭氧條件發(fā)酵顯示甲酸、乙酸和丁酸分別在12、36和24 h達(dá)到最大值0.137 9、3.142和2.521 g/L。結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格厭氧比兼性厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)酸階段時(shí)間延長(zhǎng)，丁酸和乙酸含量分別高出9.69%和31.02%。總體來(lái)說(shuō)，Bacillus sp.C2在兼性厭氧比之嚴(yán)格厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生的溶劑量高出9.01%，酸類(lèi)的總含量卻低10.99%。

2.3 關(guān)鍵酶活性分析

丁醇發(fā)酵過(guò)程中12～72 h細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵酶酶活性變化檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。乙醇脫氫酶是乙醇途徑中依賴(lài)NAD+將乙醛氧化還原為乙醇的關(guān)鍵酶，其酶活性在嚴(yán)格厭氧和兼性厭氧條件下存在顯著差異(圖3A)。在發(fā)酵初期12 h產(chǎn)酸階段，嚴(yán)格厭氧條件下的菌體胞內(nèi)乙醇脫氫酶活性已經(jīng)達(dá)到最高值1.766 U/mg，比兼性厭氧條件下的菌體胞內(nèi)酶活性高21.29%，之后嚴(yán)格厭氧條件下的乙醇脫氫酶酶活性開(kāi)始下降，兼性厭氧條件乙醇脫氫酶活性逐漸上升，并在36 h達(dá)到最大值1.752 U/mg。整個(gè)酶活性變化過(guò)程分析可知，發(fā)酵36 h之前嚴(yán)格厭氧發(fā)酵菌體胞內(nèi)乙醇脫氫酶活性由大到小的變化，而兼性厭氧發(fā)酵胞內(nèi)酶活性由小到大的變化，導(dǎo)致嚴(yán)格厭氧發(fā)酵初期乙醇的產(chǎn)生速率高于兼性厭氧發(fā)酵;但是從36 h后兼性厭氧發(fā)酵菌體胞內(nèi)乙醇脫氫酶酶活性高于嚴(yán)格厭氧發(fā)酵乙醇脫氫酶活性，并且兼性厭氧條件下胞內(nèi)乙醇脫氫酶酶活性維持時(shí)間長(zhǎng)、下降速率小;這期間乙醇產(chǎn)生速率加快，最后乙醇產(chǎn)量兼性厭氧比嚴(yán)格厭氧發(fā)酵高出18.99%。

丁醇脫氫酶和丁醛脫氫酶是丁醇產(chǎn)生途徑的關(guān)鍵酶，丁醛脫氫酶依賴(lài)NAD+作用于丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丁醛，然后丁醇脫氫酶依賴(lài)于NADP+作用于丁醛使其轉(zhuǎn)化為丁醇。此二者酶活性的高低、酶活性保持時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響到丁醇的產(chǎn)量。如圖3B、3C所示，發(fā)酵初期12 h，嚴(yán)格厭氧條件二者酶活性分別1.169和0.131 U/mg，分別高出兼性厭氧條件下丁醇脫氫酶和丁醛脫氫酶4.09%和18.01%，此后兩種酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。發(fā)酵12 h后兼性厭氧條件下的丁醇脫氫酶和丁醛脫氫酶酶活性開(kāi)始增長(zhǎng)，并在36 h達(dá)到最高值，酶活性分別為1.272和0.132 U/mg，比嚴(yán)格厭氧分別高 12.4%和12.8%。此現(xiàn)象與乙醇脫氫酶活性變化規(guī)律一致。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得丁醇產(chǎn)量數(shù)據(jù)顯示，兼性厭氧發(fā)酵比嚴(yán)格厭氧發(fā)酵丁醇產(chǎn)量提高11.50%(圖3B、3C)。

圖3 Bacillus sp.C2在兼性厭氧與嚴(yán)格厭氧條件下6種關(guān)鍵酶活性變化Fig.3 Changes of Bacillus sp.C2 about six kinds of key enzyme activity under facultative anaerobic and strictly anaerobic condition

輔酶A轉(zhuǎn)移酶是丙酮支路的關(guān)鍵酶，也是乙酸逆向生成乙酰輔酶A和丁酸逆向代謝生成丁酰輔酶A過(guò)程中的關(guān)鍵酶。當(dāng)發(fā)酵液中乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽累積生成并作為基質(zhì)的時(shí)候，CoA T的活性開(kāi)始增長(zhǎng)至最大值［18-19］。若是菌體細(xì)胞內(nèi)缺乏CoA T表達(dá)活性，將導(dǎo)致溶劑丁醇產(chǎn)量的降低或者沒(méi)有丁醇產(chǎn)生，CoA T活性缺乏的菌株大多數(shù)伴隨著丁醇脫氫酶活性的缺乏［15］。如圖3 D中嚴(yán)格厭氧發(fā)酵菌體胞內(nèi)CoA T的活性在12 h達(dá)到最高值2.47 U/mg，隨后逐漸下降;兼性厭氧發(fā)酵菌體胞內(nèi)CoA T的活性在整個(gè)檢測(cè)范圍內(nèi)先升高后降低，最高點(diǎn)在36 h的2.48 U/mg。兼性厭氧條件下CoA T的活性明顯比嚴(yán)格厭氧條件下酶活性保持時(shí)間久，直接導(dǎo)致兼性厭氧條件丙酮產(chǎn)量高于嚴(yán)格厭氧條件丙酮產(chǎn)量6.1%。分析乙酸和丁酸產(chǎn)量變化(圖2C、2D)發(fā)現(xiàn)丁酸存在逆向重復(fù)吸收利用的現(xiàn)象，可以推測(cè)CoA T活性高低是丙酮合成與酸類(lèi)物質(zhì)逆向轉(zhuǎn)化吸收重要的因素之一，特別是在丁酸逆向轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A后再經(jīng)過(guò)丁醇脫氫酶/丁醛脫氫酶轉(zhuǎn)化生成丁醇途徑起到的作用更加明顯。

乙酸激酶和丁酸激酶分別作用于乙酰磷酸去磷酸化和丁酰磷酸去磷酸化產(chǎn)生乙酸和丁酸，同時(shí)產(chǎn)生能量ATP［20］。乙酸和丁酸的累積會(huì)通過(guò)上述CoA T的作用進(jìn)行重復(fù)吸收分別轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和丁酰輔酶A，它們分別是乙醇和丁醇合成途徑中重要的中間代謝物。圖3E、圖3F分別是Bacillus sp.C2菌株在嚴(yán)格厭氧和兼性厭氧發(fā)酵過(guò)程中乙酸激酶和丁酸激酶的變化趨勢(shì)圖。嚴(yán)格厭氧條件下的乙酸激酶和丁酸激酶活性在檢測(cè)范圍初期(12 h)分別為0.251和0.301 U/mg，比兼性厭氧高31.3%和77.1%，隨著發(fā)酵的繼續(xù)兼性厭氧條件酶活性開(kāi)始上升，發(fā)酵24 h達(dá)到最高值，此時(shí)的酶活性超越嚴(yán)格厭氧條件下的酶活性。對(duì)照乙酸和丁酸產(chǎn)量變化亦可發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)格厭氧比之兼性厭氧條件乙酸和丁酸的產(chǎn)量高。

3 討論

目前報(bào)道的丁醇產(chǎn)生菌多數(shù)均為專(zhuān)性厭氧的梭狀芽孢桿菌，主要是 C.beijerinckii、C.acetobutylicum、C.saccharoperbutylacetonicum、C.saccharobutylicum4個(gè)種［21-22］。專(zhuān)性厭氧發(fā)酵對(duì)儀器設(shè)備有著嚴(yán)格的要求，加大了丁醇生產(chǎn)的成本。另外對(duì)于專(zhuān)性厭氧微生物來(lái)講，氧氣的存在對(duì)微生物的生長(zhǎng)、代謝途徑、底物消耗和產(chǎn)物產(chǎn)生均帶來(lái)負(fù)面影響。早在20世紀(jì)30年代Kanysi和Dutky已經(jīng)研究了氧氣對(duì)丁醇產(chǎn)生菌的影響，發(fā)現(xiàn)氧氣的存在下菌體生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制［23］。此后 O’Brien和 Morris同樣研究了氧氣對(duì)C.acetobutylicum生長(zhǎng)和代謝的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)氧氣的含量上升到一定值，底物消耗速率明顯降低，菌體體內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成終止，還會(huì)導(dǎo)致芽孢形成的加劇［24］。因此，提高丁醇發(fā)酵菌株對(duì)氧氣的耐受能力是降低丁醇發(fā)酵成本、優(yōu)化發(fā)酵工藝、提高發(fā)酵產(chǎn)物量及促進(jìn)丁醇工業(yè)化發(fā)酵的關(guān)鍵突破點(diǎn)之一。

王少華等［25］研究了利用氧氣控制發(fā)酵培養(yǎng)基氧化還原電位對(duì)Clostridium acetobutylicum DSM 1731丁醇發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)控制不同值的氧化還原電位導(dǎo)致不一樣發(fā)酵結(jié)果，特別是控制氧化還原電位在-290 mV溶劑總產(chǎn)量比對(duì)照組提高了35%，同時(shí)分析代謝流顯示溶劑化階段提前，發(fā)酵前24 h的碳代謝流明顯增強(qiáng)。碳代謝流的增強(qiáng)影響乙酰輔酶A、乙酰乙酰輔酶A和丁酰輔酶A等中間代謝物累積，而它們又是乙醇、丙酮和丁醇產(chǎn)生的前體，因此在適當(dāng)?shù)难趸€原電位值可以促進(jìn)細(xì)胞碳代謝流從而提高溶劑的產(chǎn)生。Kim 等［26］對(duì) Clostridium acetobutylicum ATCC 824關(guān)于不同值的氧化還原電位發(fā)酵研究也得出類(lèi)似論點(diǎn)，當(dāng)選擇一個(gè)適當(dāng)氧化還原電位值丁醇的產(chǎn)量可能會(huì)明顯提高。

本研究中Bacillussp.C2在兼性厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生溶劑量高于嚴(yán)格厭氧發(fā)酵產(chǎn)生溶劑量的11.5%。對(duì)不同溶氧量條件下的關(guān)鍵酶活性檢測(cè)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，兼性厭氧比嚴(yán)格厭氧條件下酶活性高，在酶活性保持時(shí)間方面也有明顯的提高，丁醇產(chǎn)量高。為今后的工作提出了新的研究方向，探索Bacillus sp.C2最佳的發(fā)酵溶氧量，然后確定其合適丁醇發(fā)酵的氧化還原電位值;分析在不同溶氧條件下細(xì)胞代謝通量的變化及差異，期望能促進(jìn)關(guān)鍵酶高效表達(dá)，提高溶劑產(chǎn)量。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)Bacillus sp.C2在不同溶氧條件下發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果整理分析得出，在兼性厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生總?cè)軇┖投〈挤謩e是13.02和9.50 g/L，丁醇的得率為0.201 g/g;嚴(yán)格厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生總?cè)軇┖投〈挤謩e是11.74和8.53 g/L，丁醇的得率為0.180 g/g;兼性厭氧比嚴(yán)格厭氧條件下總?cè)軇┖投〈挤謩e提高11.50%和9.01%。關(guān)鍵酶活性結(jié)果對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵延滯期兼性厭氧條件下乙醇脫氫酶、丁醇脫氫酶、丁醛脫氫酶、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶乙酸激酶、丁酸激酶活性低于嚴(yán)格厭氧條件下其酶活性。然而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到24 h之后，兼性厭氧條件下的酶活性逐步超越嚴(yán)格厭氧條件酶活性且持續(xù)增長(zhǎng)至36 h后開(kāi)始緩慢降低，并且兼性厭氧比嚴(yán)格厭氧條件下酶活性保持時(shí)間較長(zhǎng)有利于溶劑產(chǎn)生。

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