己酮可可堿預處理對硫代乙酰胺致大鼠急性肝損傷的影響

羅妙莎，董 蕾，郭曉燕，李 晶，秦 斌(西安交通大學第二附屬醫院消化內科，西安 710004;通訊作者，E-mail:dong556@126.com)

急性肝損傷(acute liver injury)是由多種原因引發肝細胞炎癥壞死，肝臟的解毒、合成、排泄、生物轉化等功能發生障礙，引起以凝血功能障礙、黃疸、腹水、肝性腦病等癥狀為特征的臨床綜合征。目前多采取綜合治療，包括去除病因、對癥支持、調節免疫功能以及防治各種并發癥的發生等［1］，但療效均不滿意。己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)是甲基黃嘌呤的衍生物，是一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，其具有改善血流動力學、改善組織細胞功能、抗炎、抗氧化以及抗纖維化等作用。研究表明，己酮可可堿對酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝纖維化均有一定的治療作用［2-4］，但其對急性肝損傷作用的研究則較少報道。本實驗旨在利用不同劑量己酮可可堿對大鼠進行預處理，觀察其對硫代乙酰胺誘導的大鼠肝臟損傷的影響并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重(200±20)g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號:SCXK(陜)08-018。所有動物實驗均符合西安交通大學醫學部動物實驗中心管理委員會有關動物管理和使用的規定。

1.1.2 藥品與試劑 己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)、硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)均購自美國Sigma公司，聯苯雙酯(bifendate)購自北京協和制藥廠，丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，實驗用其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備及給藥方案 普通飼料適應性喂養SD大鼠1周，自由飲食飲水，溫度為20-25℃，濕度為(50±5)%，光照周期為12 h∶12 h。1周后隨機分為6組:正常對照組，急性肝損傷模型組，聯苯雙酯［100 mg/(kg·d)］陽性對照組，己酮可可堿低［50 mg/(kg·d)］、中［100 mg/(kg·d)］、高［200 mg/(kg·d)］劑量干預組，每組10只，雌雄各半。給藥方案:從實驗第1天起，低、中、高劑量干預組大鼠分別給予 PTX 50，100，200 mg/(kg·d)灌胃干預［5］，陽性藥物組給予聯苯雙酯100 mg/(kg·d)灌胃干預，模型組及正常組給予蒸餾水10 ml/(kg·d)灌胃，連續10 d;實驗第11天，模型組、陽性藥物組及低、中、高劑量干預組給予TAA 300 mg/kg腹腔注射［6］，正常組給予等體積生理鹽水7.5 ml/kg腹腔注射。24 h后，給予10%的水合氯醛3-4 ml/kg腹腔注射麻醉處死各組大鼠。

1.2.2 血清指標檢測 大鼠麻醉后開腹，常規腹主動脈取血5 ml，應用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

1.2.3 肝組織指標檢測 取相同部位的肝左葉組織，在冰生理鹽水中漂洗后，濾紙拭干，用組織勻漿器將肝組織制成10%的勻漿，離心后取上清，測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)的含量，以上各指標的測定操作步驟均按相關試劑盒說明書進行。

1.2.4 肝組織病理學檢查 取肝組織做橫斷面取材，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，并在光學顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用±s表示，在滿足正態性及方差齊性的條件下，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗;不滿足正態性和方差齊性的條件時，采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清中ALT、AST的含量

與正常組相比，模型組大鼠血清ALT、AST含量明顯升高，差異具有統計學意義(P＜0.01);與模型組相比，陽性對照組及中、高劑量干預組血清ALT、AST均明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.01)，低劑量干預組ALT、AST雖有所下降，但其差異無統計學意義(P＞0.05);與陽性藥物組相比，中、高劑量干預組血清 ALT、AST差異無統計學意義(P＞0.05，見圖1)。

圖1 各組大鼠血清中ALT、AST的濃度比較Figure 1 The serum contents of ALT and AST in each group

2.2 肝組織中MDA、SOD、GSH的含量

與正常組相比，模型組小鼠肝組織勻漿中MDA水平顯著升高，同時SOD、GSH水平顯著下降，差異具有統計學意義(P＜0.01)。與模型組相比，陽性藥物組及中、高劑量干預組MDA均顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.01)，SOD、GSH 水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，低劑量干預組雖MDA下降且SOD、GSH水平升高，但其差異無統計學意義(P＞0.05);與陽性藥物組相比，中、高劑量干預組肝組織中MDA、SOD、GSH的含量變化差異無統計學意義(P ＞0.05，見圖2)。

2.3 肝組織病理學檢查

2.3.1 肉眼觀察 正常組大鼠肝臟外觀呈現深紅色，表面光滑，邊緣銳利，質地柔軟，富有彈性;模型組及低劑量干預組大鼠肝臟表面有瘀血點，肝臟包膜無光澤;陽性藥物組及中、高劑量干預組肝臟變化介于上述兩種表現之間，較模型組肝臟變化明顯好轉。

2.3.2 光鏡下觀察 正常組肝小葉結構完整，以中央靜脈為中心呈現放射狀排列，肝索排列整齊，肝細胞無變性及壞死，肝小葉及匯管區無炎細胞浸潤。模型組小葉結構破壞，肝細胞腫脹，細胞質疏松化，炎性細胞浸潤;陽性藥物組及中、高劑量干預組肝小葉結構較完整，肝細胞水腫較輕;低劑量干預組肝組織鏡下表現介于以上兩種表現之間(圖3，見第502頁)。

圖2 各組大鼠肝組織勻漿中MDA、SOD、GSH的濃度比較Figure 2 The contents of MDA，SOD and GSH in liver tissues of each group

3 討論

急性肝損傷時引發肝細胞炎癥或壞死，并繼發后續一系列病理過程，因而保護肝細胞，可減少各種有害因素對肝臟的損傷。己酮可可堿(PTX)是一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，因其具有擴血管、改善微循環、改善細胞缺氧、抗炎、抗氧化以及免疫調節等作用，已被研究證實能有效預防和改善腦缺血、肺纖維化、肝纖維化、脂肪肝、酒精性肝病等疾病［7］。本研究通過硫代乙酰胺(TAA)復制急性肝損傷模型，證實己酮可可堿預處理對大鼠急性肝損傷有一定的保護作用。

TAA誘導的急性肝損傷與人類肝損傷特點較為接近，能很好地反映人類肝損傷實際的情況。TAA可使血清ALT、AST水平顯著升高，病理學提示肝細胞變性壞死，肝臟病理學變化也較為均一［8］，因此被廣泛應用于肝損傷的機制研究中。本研究結果顯示，與正常對照組相比較，模型組血清中AST、ALT含量及肝組織中MDA水平明顯升高，而肝組織中SOD、GSH水平顯著降低(P＜0.01);肝臟病理學檢查提示，模型組肝臟結構破壞，出現炎性細胞浸潤，這與以往研究中 TAA造模的結果相一致［6］，提示本實驗中TAA誘導的大鼠急性肝損傷模型是可行的。

丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及門冬氨酸氨基轉移酶(AST)通常存在于正常肝細胞內，當肝細胞受損破裂時外排入血，是常用的反映肝實質損傷的酶學指標。本研究結果顯示，PTX中、高劑量預處理干預后，大鼠血清AST、ALT水平顯著降低。肝組織病理學檢查證實肝小葉結構較完整，肝細胞水腫減輕，效果與聯苯雙酯陽性藥物對照組接近，提示PTX預處理可有效減輕TAA誘導的大鼠急性肝損傷，且具有一定的劑量依賴性。此外，既往研究證實己酮可可堿還可有效改善慢性肝損傷的肝臟病理變化，延緩慢性肝損傷的發生、發展，對慢性肝損傷也有一定的治療作用［9，10］。

急性肝損傷發生的機制頗為復雜，各種有害因素作用于肝臟，產生有毒中間代謝產物損傷肝臟，例如改變細胞膜的完整性、細胞線粒體功能失調、細胞內外離子濃度變化、降解肝酶的活性、自由基的作用等，同時也可誘發免疫機制，通過補體、細胞因子及免疫變態反應等產生損傷，以往的研究顯示，氧化應激在肝損傷中發揮著重要作用［11］。氧化應激是由于自由基生成與清除平衡被破壞，導致自由基及其代謝產物蓄積，這些自由基可激活磷脂酶發生脂質過氧化反應，致使過氧化的終產物MDA等增加，體內抗氧化及抗脂質過氧化作用成分如SOD、GSH等含量下降，造成肝細胞變性壞死，肝功能受損［12］。因此，通過聯合檢測MDA、SOD及GSH的含量，可以反映機體細胞受到自由基攻擊的嚴重程度。實驗研究及臨床研究顯示，PTX可促進氧化和抗氧化機制平衡的恢復，阻斷自由基鏈式反應，使細胞結構及功能恢復正常［5，13-15］。本研究結果顯示，與模型組相比，PTX中、高劑量預處理能夠增加大鼠肝組織中SOD及GSH水平并顯著降低MDA含量。因此我們推測PTX可能通過增強體內的抗氧化劑活性，減輕脂質過氧化作用，改善體內自由基生成和清除系統的平衡狀態，從而減輕肝細胞的損傷，對急性肝損傷大鼠起到一定保護作用。但本研究中并未涉及己酮可可堿增強急性肝損傷中抗氧化應激作用的具體機制，有待進一步的研究。

本研究結果顯示，PTX可通過清除體內過多自由基及減輕脂質過氧化作用，減少肝細胞的損傷，改善肝組織的病理變化，從而對急性肝損傷的發生、發展起到一定的抑制作用。綜上所述，PTX具有治療急性肝損傷的潛在價值，為應用于臨床治療急性肝損傷提供了理論依據。

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