結腸癌組織中凋亡抑制基因Livin的表達及臨床意義

葉 蕓，李蘇亮，鄭乃青(西安醫學院第一附屬醫院中心實驗室，西安 710077;通訊作者，E-mail:yeyun236@163．com)

結腸癌是在環境或遺傳等多種致癌因素作用下發生的消化系統惡性腫瘤。近年來，關于結腸癌的基礎和臨床研究已取得很大進步，但病因學和發病機制尚未完全闡明。腫瘤的發生、發展與細胞增殖和細胞凋亡失衡有關，是多基因參與過程。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一類內源性凋亡抑制因子家族，其過度表達引起細胞凋亡缺陷與腫瘤發生密切相關［1］。Livin基因是IAP家族成員，已有研究表明Livin基因是某些腫瘤診斷和治療的潛在靶點［2］。然而，Livin基因在結腸癌發病中的作用、惡性侵襲和轉移的表達，以及是否可作為早期診治的靶點鮮見報道。本文通過研究凋亡抑制基因Livin在結腸癌組織中的表達及臨床意義，旨在探討Livin表達在結腸癌的臨床診斷及病情評估中的作用。

1 材料和方法

1．1 研究對象

收集西安醫學院第一附屬醫院腫瘤外科2009－02－10～2012－06－31已行手術切除并經病理確診的結腸癌新鮮標本96例，術前均未接受過化療或放療治療，女性32例，男性64例，年齡38－72歲，平均年齡(57±7．12)歲。結腸癌TNM分期采用AJCC標準(2010)，組織分型采用Lauren分型，結果顯示病理類型:高分化癌17、中分化癌26例，低分化癌53例;出現淋巴結轉移者42例，未出現轉移54例;TNM分期:Ⅰ－Ⅱ期35例，Ⅲ－Ⅳ期61例。對照組:選取30例癌旁正常結腸組織(距腫瘤邊緣5 cm以上組織)。將每次所獲得的新鮮組織的一部分保護于RNA Waiter中，后存放于－80℃冰箱中，用于RT-PCR，另一部分新鮮組織經10%甲醛固定，石蠟包埋常規連續切片，用于免疫組織化學檢測。

1．2 主要試劑與儀器

Trizol購于美國Sigma公司;逆轉錄試劑盒購于大連TAKARA生物科技公司(日本);puc19 Marker購于美國MBI生物科技公司;Taq酶購于日本Toyobo公司;PCR反應的引物由北京鼎國生物技術有限公司合成。

1．3 免疫組織化學染色檢測Livin蛋白表達

即用型鼠抗人單抗(珠海市泉暉企業有限公司)按SP法進行免疫組織化學染色。DAB顯色，蘇木精襯染，常規脫水、透明、封片。用PBS代替一抗進行染色，作為陰性對照;用已知各抗體的陽性對照片作陽性對照。實驗結果評定標準:Livin染色陽性信號呈棕黃色細胞顆粒狀，主要定位在細胞質中，在100倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野，然后采用Image-Proplus5．0分析軟件在400倍光鏡下對陽性表達進行定量分析，計算每個視野陽性染色的積分光密度(integral optical density，IOD)值，取5個視野IOD的均值為各組最終數據。

1．4 RT-PCR檢測Livin mRNA水平

Livin基因上游引物:5’－CCTGGTCTGTGCTGAGTGT－3’(上游)，5’－CTGGTCAGTGCTGGATGGA－3’(下游)，產物長度為 214 bp。10×buffer 5 μl、dNTP 4 μl、cDNA 5 μl、上下游引物各 5 μl、Tap酶 1 μl、PCR 用水 29 μl共 50 μl。PCR 反應條件:94℃5 min、94℃1 min、58℃1 min退火、72℃延伸2 min共29循環。72℃10 min延長。

1．5 統計學分析

選擇結腸癌患者的性別、年齡、浸潤深度、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移及遠處轉移等與臨床相關的因素，將Livin在各因素之間的表達情況行統計學分析。所有實驗數據采用SPSS17．0軟件系統分析所有數據，兩組積分光密度值以±s表示，采用兩樣本t檢驗進行分析;分類變量采用χ2檢驗或確切概率法進行分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 免疫組化染色結果

Livin染色的陽性物質呈棕黃色，表達于細胞膜、胞質(圖1，見第504頁)。結腸癌組積分光密度值為147．67 ±5．09，對照組積分光密度值為112．68 ±4．51，兩組比較差異有統計學意義(t=24．31，P ＜0．05)。

2．2 RT-PCR檢測結果

96例結直腸癌組織中77例Livin mRNA表達陽性(見圖2)，陽性率為80．2%，呈高表達;30例對照組正常結腸組織1例表達陽性，陽性率為3．3%，呈低表達。兩組比較差異有統計學意義(χ2=57．28，P ＜0．05)。

圖2 結腸癌組織、正常結腸組織中livin基因電泳條帶圖Figure 2 Electrophoresis banding of Livin gene in colon cancer tissue and normal colon tissue

2．3 Livin與結腸癌患者臨床病理特征的關系

將96例患者的各項臨床相關資料行統計學分析，結果顯示:Livin基因表達與TNM分期、分化程度及浸潤深度有關，兩組間差異有統計學意義(P＜0．05)，與性別、年齡、腫瘤病灶大小、是否有遠處轉移、有無淋巴結轉移均無關(P＞0．05，見表1)。

表1 Livin基因表達與臨床病理特征的關系 例(%)Table 1 The relationship between Livin expression and clinical pathological features cases(%)

3 討論

近年，結腸癌已成為我國發病率增長最快的惡性腫瘤之一，其發病率增長了100%。每年大約有14萬人新患結腸癌，占全部癌癥患者的6．8%。IAP是一類內源性細胞抑制因子，其過度表達引起細胞凋亡不足與腫瘤發生密切相關［3］。Livin是IAP成員，Ashhab等［4］經序列分析顯示Livin蛋白質有兩種剪切異構體，長度分別為1 321 bp及1 267 bp，分別稱為Livin α及Livin β。Livin基因位于人染色體20q13．3，全長4．6 kb，包含 7 個外顯子和 6 個內含子。Livin在N端含有一個BIR結構域，C端含有一個RING結構域。Livin BIR包含4個α螺旋、1個三股的反平行β片層以及相應的氨基酸殘基共同構成的疏水核心。Livin α cDNA全長897，編碼298個氨基酸;Livin β cDNA全長843，編碼280個氨基酸。Livin α與β，除了在BIR與RING間相差18個氨基酸外，兩者結構非常相似，兩者相差的18個氨基酸由介于BIR和RING結構之間的第6外顯子5’端54的基因序列編碼。Livin在胚胎組織中存在，在胎兒發育過程中多種組織高表達，在正常成人的大多數終末組織中(除胎盤)低表達或不表達，正常大腸組織中無 Livin基因的表達［5－7］。

隨著對多種腫瘤中Livin的研究，顯示Livin在很多腫瘤組織中表達，如在黑色素瘤、人子宮頸癌Hela細胞、人肝癌細胞、非小細胞肺癌細胞、白血病T細胞、鼻咽癌上均有顯著性過表達現象［8，9］，這些研究結果提示，Livin的表達可能是維持腫瘤細胞在體內生長的重要因素。最近研究還發現在消化道腫瘤中，如胃癌、胰腺癌及肝癌中均見Livin呈過度表達［10］。

腫瘤的發生、發展與細胞增殖和細胞凋亡失衡有關，是多基因參與過程。已有研究表明，Livin基因是某些腫瘤診斷和治療的潛在靶點［11］。然而，Livin基因在結腸癌發病機制中的作用、惡性生物學行為(侵襲和轉移)的表達，以及是否可作為早期診斷及治療的靶點鮮見報道。本實驗采用免疫組化及PCR技術檢測了Livin基因在結腸癌組織及正常結腸組織中的表達情況，發現Livin基因在結腸癌組織中高表達，在正常結腸組織中低表達;Livin基因表達與TNM分期、分化程度及浸潤深度有關，與性別、年齡、腫瘤病灶大小、是否有遠處轉移、有無淋巴結轉移均無關。因此，檢測Livin基因在結腸癌組織中的表達對結腸癌的臨床診斷及病情評估有重要作用。

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