長(zhǎng)QT綜合征2型HERG基因綠色熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

韓穩(wěn)琦，李國(guó)良，程 功，呂 穎，武金娥，蔣永榮，孫超峰(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，教育部心臟離子通道病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 7006;陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科;通訊作者，E-mail:csun@63.com)

長(zhǎng)QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是指具有心電圖上QT間期延長(zhǎng)，T波異常，易產(chǎn)生室性心律失常，尤其是尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速(TdP)、暈厥和猝死的一組綜合征［1］。目前已發(fā)現(xiàn)12種LQTS相關(guān)基因，LQT2是由于第7對(duì)染色體的7q35.36位點(diǎn)上的HERG基因(human ether-a-go-go related gene，HERG)發(fā)生突變所致［2］。HERG 編碼心臟快速延遲整流鉀通道(IKr)α亞單位，是動(dòng)作電位2期重要的外向電流［2］。HERG基因突變可使IKr振幅減低導(dǎo)致心內(nèi)膜、心外膜和M細(xì)胞復(fù)極不均一，從而誘發(fā)早期后除極(EAD)和尖端扭轉(zhuǎn)性室速(TdP)，導(dǎo)致表型功能缺陷的LQT2［3］。由HERG基因突變所致LQT2占LQTS已知突變45%，為我國(guó)最常見(jiàn)的臨床類型［4］。而且IKr既是多種藥物致QT間期改變甚至誘發(fā)心律失常的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)也是抗心律失常藥治療的重要靶位點(diǎn)［5］。目前，研究HERG基因功能的方法主要是構(gòu)建真核表達(dá)載體，建立HERG基因表達(dá)的細(xì)胞模型，并應(yīng)用細(xì)胞模型進(jìn)行致病機(jī)制及藥物研究。

本研究將野生型HERG構(gòu)建至表達(dá)綠色熒光蛋白的 pEGFP-C2真核表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞(人胚胎腎組細(xì)胞)構(gòu)建表達(dá)綠色融合蛋白細(xì)胞模型，通過(guò)檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)來(lái)反映目的蛋白產(chǎn)物的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)及定位。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3-HERG質(zhì)粒(抗氨芐霉素抗性)和pD-sRed2-ER質(zhì)粒由美國(guó)威斯康辛大學(xué)BD Anson博士惠贈(zèng)，pEGFP-C2質(zhì)粒(抗卡那霉素特性)購(gòu)自Clontech公司(日本)，Eco RⅠ和Hin dⅢ限制性內(nèi)切酶、Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA聚合酶、500-15 000 bp DNA ladder購(gòu)自 Fermentas公司(加拿大)，膠回收試劑盒購(gòu)自 Tiangen公司，X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自羅氏公司(瑞士)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購(gòu)自Hyclone公司，核酸染料購(gòu)自西安昕泰生物公司，卡那霉素購(gòu)自沃爾森公司，抗體均購(gòu)自sigma公司(日本)。2000型凝膠成像系統(tǒng):美國(guó)伯樂(lè)公司，DH5α大腸桿菌、HEK293細(xì)胞取自西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 真核表達(dá)載體pEGFP-C2-HERG的構(gòu)建

利用HERG基因外側(cè)的Eco RⅠ和Hin dⅢ限制性內(nèi)切酶對(duì)pcDNA3-HERG及pEGFP-C2同時(shí)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收pEGFP-C2單一片段和pcDNA3的小片段產(chǎn)物，利用T4DNA聚合酶將二者進(jìn)行連接，構(gòu)建成pEGFP-C2-HERG。制備LB液體培養(yǎng)基及LB-卡那霉素瓊脂糖培養(yǎng)平板篩選，采用大腸桿菌DH5α對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，16 h后挑選白色單克隆菌落，接種于30 ml LB-卡那酶素培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增，堿裂解法提取質(zhì)粒后行瓊脂糖凝膠初步檢測(cè)新合成質(zhì)粒的位置，由于pEGFP-C2和HERG基因都有單一的Bam HⅠ酶切位點(diǎn)，pEGFP-C2-HERG經(jīng)Bam HⅠ酶切后再次行瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切位置。將新構(gòu)建的質(zhì)粒送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 HEK293 細(xì)胞(human embryo kidney cell)的轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)定位

用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基在6孔板培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%-85%時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染預(yù)混物，包括無(wú)血清DMEM 100 μl、轉(zhuǎn)染劑 4 μl，各組質(zhì)粒比例:對(duì)照組 pcDNA空載體 2 μg;pcDNA3-HERG 2 μg;pEGFP-C2-HERG 2 μg。轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)。隨后提取各組蛋白行Western blot檢測(cè)HERG蛋白表達(dá)。

將pEGFP-C2-HERG與特異性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá)紅色熒光的pDsRed2-ER質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡活體細(xì)胞檢測(cè)，明確蛋白表達(dá)定位。轉(zhuǎn)染預(yù)混物，包括無(wú)血清 DMEM 100 μl、轉(zhuǎn)染劑4 μl，pEGFP-C2-HERG 2 μg 及 pDsRed2-ER 1 μg。共轉(zhuǎn)染24 h后于激光共聚焦顯微鏡下觀察活體細(xì)胞蛋白表達(dá)定位。

2 結(jié)果

2.1 綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-HERG的構(gòu)建

用Eco RⅠ和Hin dⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切pEGFP-C2和pcDNA3-HERG，因Eco RⅠ和Hin dⅢ在pEGFP-C2上為相鄰酶切位點(diǎn)，故酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示一條帶，大小約為4.7 kb;pcDNA3-HERG被切成兩條帶，大小分別為3.9 kb和5.4 kb，瓊脂糖電泳見(jiàn)圖1。

T4 DNA連接酶將pcDNA3-HERG的小片段回收部分和pEGFP-C2連接起來(lái)，重組成pEGFP-C2-HERG綠色熒光真核表達(dá)載體，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)連接后產(chǎn)物，片段大小應(yīng)為約9 kb，重組后的電泳條帶大小和位置正確(見(jiàn)圖2)，說(shuō)明目的片段成功重組至真核表達(dá)載體pEGFP-C2-HERG中。

圖2 新構(gòu)建質(zhì)粒pEGFP-C2-HERG電泳圖Figure 2 Agarose gel electrophoresis of new combined plasmid pEGFP-C2-HERG

2.2 綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C2-HERG的鑒定

由于pEGFP-C2和HERG基因都有單一的Bam HⅠ酶切位點(diǎn)，因此 pEGFP-C2-HERG可被Bam HⅠ切成兩條帶，大小分別為4 kb和5 kb，位置正確(見(jiàn)圖3)，再次證明HERG基因已經(jīng)成功連接到pEGFP-C2上。

圖3 pEGFP-C2-hERG酶切電泳圖Figure 3 Agarose gel electrophoresis of pEGFP-C2-HERG by restriction enzyme

新構(gòu)建pEGFP-C2-HERG經(jīng)測(cè)序后與HERG堿基模板比對(duì)，結(jié)果顯示pEGFP-C2載體中插入的HERG堿基序列與模板序列完全一致，保證了正常HERG蛋白的表達(dá)及通道功能的實(shí)現(xiàn)。

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型pEGFP-C2-HERG的HEK293細(xì)胞蛋白提取物檢測(cè)到HERG通道蛋白，在135 kD和155 kD處出現(xiàn)兩條蛋白質(zhì)條帶，而轉(zhuǎn)染新構(gòu)建的pEGFP-C2-HERG細(xì)胞蛋白提取物出現(xiàn)兩個(gè)條帶，分別在約160 kD和180 kD處(見(jiàn)圖4)。

圖4 pcDNA3-HERG和pEGFP-C2-HERG轉(zhuǎn)染細(xì)胞后HERG蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of HERG protein after pcDNA3-HERG and pEGFP-C2-HERG were transfected into cells by Western blot

2.3 pEGFP-C2-HERG在細(xì)胞中的表達(dá)定位

將新構(gòu)建的pEGFP-C2-HERG轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，熒光鏡下可見(jiàn)明亮的綠色熒光，轉(zhuǎn)染的pcDNA3-HERG載體質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞均未見(jiàn)綠色熒光表達(dá)(圖5 ，見(jiàn)第501頁(yè))。

用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HERG基因pEGFPC2-HERG的蛋白表達(dá)定位發(fā)現(xiàn)，野生型HERG表達(dá)的通道蛋白主要位于細(xì)胞膜上，部分蛋白滯留于胞質(zhì)中(圖6，見(jiàn)第502頁(yè))。當(dāng)與僅表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中的紅色熒光pDsRed2-ER質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)新構(gòu)建的pEGFP-C2-HERG真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，疊加圖像后清晰可見(jiàn)攜帶有HERG的綠色熒光蛋白呈線性定位于細(xì)胞膜上，形成膜通道蛋白。

3 討論

先天性長(zhǎng)QT綜合征(LQTS)為編碼心臟離子通道的基因發(fā)生突變導(dǎo)致膜蛋白功能異常致動(dòng)作電位復(fù)極時(shí)程延長(zhǎng)而表現(xiàn)為暈厥或猝死的一種臨床綜合征。由于該病發(fā)病突然，猝死率高，近年來(lái)對(duì)該疾病基因型和表現(xiàn)型關(guān)系的突破性進(jìn)展及分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，使LQTS成為近來(lái)心臟離子通道研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。對(duì)LQTS患者基因報(bào)道顯示［6］，2 型 LQTS 約占總 LQTS 的 46%，當(dāng)編碼 IKr通道的HERG基因突變則導(dǎo)致IKr外向電流減少或消失，引起APD復(fù)極延長(zhǎng)，導(dǎo)致LQT2。Sanguinetti等研究還發(fā)現(xiàn)除少數(shù)幾種藥物外，幾乎所有藥物性LQTS均由于抑制HERG通道或減小其電流所致［7］。因此HERG的研究對(duì)心律失常的診治和藥物研發(fā)意義深遠(yuǎn)。

目前，對(duì)治病相關(guān)基因的研究中，廣泛采用將目的基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因構(gòu)建成表達(dá)綠色熒光融合蛋白的重組質(zhì)粒，構(gòu)建細(xì)胞模型后可于熒光顯微鏡下通過(guò)綠色熒光示蹤直接觀察目的蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)和定位的變化。增強(qiáng)型GFP(EGFP)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種分子量較小并優(yōu)化的突變型增強(qiáng)GFP，表達(dá)蛋白約27 kD，其在藍(lán)光激發(fā)時(shí)可高效表達(dá)明亮的綠色熒光，且較普通GFP強(qiáng)約30余倍，很大程度上增強(qiáng)了其報(bào)告基因的敏感度［8］。

此實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建包含HERG基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C2。為進(jìn)一步驗(yàn)證重組的真核表達(dá)載體質(zhì)粒能否于宿主細(xì)胞中成功表達(dá)目的基因及綠色示蹤蛋白，本實(shí)驗(yàn)采用了無(wú)內(nèi)源性的IKr電流表達(dá)的人胚胎腎祖細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)［9］，結(jié)果示重組的真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中。綠色熒光蛋白表達(dá)豐富，故目的基因和GFP形成的融合蛋白在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證重組真核表達(dá)載體水平為融合蛋白狀態(tài)，將野生型pcDNA3-HERG和新構(gòu)建pEGFPC2-HERG真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，提取蛋白經(jīng)Western blot法證實(shí)野生型pcDNA3-HERG通道蛋白存在約135 kD和155 kD處2條蛋白質(zhì)條帶，與Gong等［10］報(bào)告的野生型HERG通道蛋白在胞質(zhì)中從135 kD完全糖基化后形成的155 kD成熟通道蛋白最終發(fā)揮通道功能結(jié)果一致。pEGFP-C2-HERG因攜帶GFP融合蛋白(27 kD)的表達(dá)，Western blot示通道蛋白位于約160 kD和180 kD處，具有同野生型pcDNA3-HERG表達(dá)類似的兩個(gè)條帶，與pcDNA3的135 kD和155 kD相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明目的基因表達(dá)的融合蛋白可進(jìn)一步加工轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上。

本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)激光共聚焦顯微鏡將pEGFP-C2-HERG經(jīng)藍(lán)光模式激發(fā)顯示胞質(zhì)和胞膜均呈綠色熒光圖像，同時(shí)共轉(zhuǎn)染的經(jīng)綠光模式激發(fā)產(chǎn)生紅色熒光并僅在胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)的pDsRed2-ER質(zhì)粒作為背景對(duì)照，疊加圖像后可見(jiàn)“綠包紅”的熒光圖像，提示pEGFP-C2-HERG表達(dá)的蛋白可呈光滑線型定位于細(xì)胞膜上，同HERG表達(dá)定位一致，二次驗(yàn)證了HERG基因編碼的IKr通道蛋白可于細(xì)胞膜上成功表達(dá)。

本研究證實(shí)GFP融合蛋白未影響目的蛋白的糖基化反應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)，所以在以后研究蛋白表達(dá)方面可完全替代pcDNA3-HERG，可高效、簡(jiǎn)便、快捷地進(jìn)行突變基因研究和大量藥物篩查干預(yù)對(duì)蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)的研究。故此融合目的基因HERG和表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞模型構(gòu)建的成功為后期闡明LQTS的發(fā)病機(jī)制和治療研究奠定了分子細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

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