西花薊馬細胞色素P450 基因cDNA 片段克隆與mRNA 表達分析

董紅剛，謝志娟，杜予州，王建軍*

(1.揚州市邗江區植保植檢站，江蘇揚州 225009;2.泰州市靖江市植保植檢站，江蘇泰州 214500;3.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009)

西花薊馬Frankliniella occidentalis 是蔬菜、果樹和觀賞作物上重要害蟲(Kirk et al.，2003)，除了直接取食作物造成危害，還能傳播番茄斑萎病毒(TSWV)和鳳仙壞死斑點病毒(INSV)(Bielza，2008)，目前在歐洲、非洲、亞洲、美洲、大洋洲等69個國家和地區都有發生和危害報道。我國自從2003年7月在北京郊區保護地的辣椒和黃瓜上首次發現了西花薊馬的入侵為害以來(張友軍等，2003)，目前在山東、云南、貴州、浙江、湖南、江蘇、西藏等地都有西花薊馬發生的報道(鄭長英等，2007;梁貴紅等，2007;袁成明等，2008;劉佳等，2010;嚴侃丹等，2010;王海鴻等，2013)，并呈進一步傳播蔓延趨勢。目前防治西花薊馬仍以化學藥劑為主要手段，但由于化學藥劑的大量使用，已經導致西花薊馬對有機氯、有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯和多殺菌素等多種殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性(Bielza，2008;陳雪林等，2011)。

阿維菌素是一種大環內酯抗生素類廣譜高效殺蟲殺螨劑，也是防治西花薊馬的主要藥劑之一。Immaraju 等(1992)研究了美國加利福尼亞沿海地區西花薊馬田間種群對阿維菌素的抗藥性，發現加利福尼亞San Diego 和Santa Barbara 地區4個西花薊馬田間種群在LC90水平上對阿維菌素分別產生了18 倍、245 倍、798 倍和101 倍的抗性。最近，Chen 等(2011)對西花薊馬敏感品系進行18 代15 次抗性選育，獲得了對阿維菌素具有45.5倍的西花薊馬抗性品系，增效實驗和解毒酶活性測定發現，西花薊馬對阿維菌素的抗性可能與多功能氧化酶活性提高有關。本文在此基礎上克隆了5個屬于CYP4 家族的西花薊馬細胞色素P450酶基因cDNA 片段，并通過實時熒光定量PCR 分析了這5個基因在西花薊馬對阿維菌素抗性和敏感品系中的表達差異。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

西花薊馬相對敏感品系(ABA-S)由浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所提供。該品系是2003年從中國農業科學院蔬菜花卉研究所的溫室甜瓜上采集的，在室內未接觸任何藥劑的情況下用豆莢法長期飼養。光照培養箱飼養條件為:溫度27℃±1℃、相對濕度60%-75%、光周期L∶D=16 h∶8 h。西花薊馬相對抗性品系(ABA-R)由Chen 等(2011)對西花薊馬相對敏感品系(ABA-S)進行阿維菌素抗性選育獲得。經過18 代15 次抗性選育，獲得了相對于敏感品系對阿維菌素抗性倍數達45.5 倍的西花薊馬抗性品系。取生長一致的相對敏感和抗性品系2 齡若蟲保存于-80℃待用。

1.2 主要試劑

pGEM-T vector 和SV total RNA isolation system購自 Promega 公司，Ex TaqTMDNA 聚合酶、PrimescriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis kit 和SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit II 購自TaKaRa公司。

1.3 總RNA 提取與cDNA 合成

相對敏感和抗性品系2 齡若蟲總RNA 的提取參照SV Total RNA isolation System 說明書。RTPCR 和熒光定量RT-PCR 所用cDNA 模板的合成分別參照PrimescriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis kit和SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit II 操作說明。

1.4 反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)

根據昆蟲CYP4 保守性氨基酸殘基設計簡并引物(表1)。25μL PCR 反應體系中含:14.5μL ddH2O;2.5μL 10×Ex TaqTMBuffer(Mg2+Free);2μL MgCl2(25 mM);2μL dNTPs(10 mM);1μL 上游/下游引物(10μM);1μL 8×Ex TaqTM聚合酶;1μL cDNA 模板。PCR 擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30s，52℃-41℃(每個循環降低1℃)退火30s，72℃延伸2 min，循環12 次;94℃變性30s，40℃退火30s，72℃延伸2 min，循環25 次;72℃延伸10 min。PCR 產物經低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收和基因純化試劑盒純化后，克隆于pGEM-T vector 并轉化到感受態大腸桿菌DH5α 中，陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司用通用引物進行序列測定。

1.5 序列分析和系統發育樹構建

利用Clustal W 進行多重序列比對。利用Mega 5 構建系統發育樹。

1.6 熒光定量PCR

根據克隆獲得的5個西花薊馬CYP4 基因的cDNA 序列設計、合成熒光定量PCR 特異性引物(表1)。以Cifuentes 等(2012)報道的β-Actin 基因作為內參基因。在20μL 實時熒光定量PCR 反應體系中含有:SYBR Premix EX TaqTMII(2×)10.0μL、基因特異性上游引物(10μM)0.8μL、基因特異性下游引物(10μM)0.8μL、ROX Reference Dye II(50×)0.4μL、cDNA 模 板2μL，滅菌超純水6.0μL。在CFX96TM實時熒光定量PCR 儀(Bio-Rad，美國)上按下列條件進行反應:95℃預變性3 min，然后95℃變性10 s、60℃退火15 s 共40個循環。反應以水為陰性對照，每個處理3 次重復。反應完成后收集Ct 值，并分析熔解曲線檢測擴增反應的特異性，對Ct 值采用2-ΔΔCt法進行定量分析，用DPS 軟件進行平均值與標準差的計算。

表1 PCR 引物Table 1 Primers used in PCR amplification

2 結果與分析

2.1 西花薊馬CYP4 基因cDNA 片段的克隆

根據昆蟲CYP4 保守性氨基酸殘基設計簡并引物通過RT-PCR 擴增出5個CYP4 基因cDNA 片段，分別命名為CYP4-1、CYP4-2、CYP4-3、CYP4-4、CYP4-5，其中CYP4-1 和CYP4-4 核苷酸序列長449 bp，編碼149個氨基酸;CYP4-2 和CYP4-3 核苷酸序列長443 bp，編碼147個氨基酸;CYP4-5核苷酸序列長446 bp，編碼148個氨基酸(圖1A和B)。多重序列比對發現，這5個基因在氨基酸水平的一致性在40%-76% 之間，并且都含有P450 蛋白的保守結構域，如螺旋K 區的保守性基序EXXRXXP 和血紅素結合區的細胞色素P450 特征性基序FXXGXRXCXG(圖1B)。系統發生分析表明這5個基因都屬于CYP4 家族(圖2)。

2.2 西花薊馬CYP4 基因mRNA 表達分析

通過實時熒光定量PCR 分析了本文克隆的5個CYP4 基因在西花薊馬敏感和阿維菌素抗性品系2 齡若蟲中的mRNA 表達水平。結果表明，抗性品系CYP4-1、CYP4-2 和CYP4-5 相對于敏感品系的表達倍數分別為3.50、4.00 和2.48 倍，但抗性品系與敏感品系CYP4-3 和CYP4-4 基因的表達水平不存在顯著差異(圖3)。

圖1 西花薊馬5個CYP4 基因的核苷酸(A)和氨基酸(B)序列比對Fig.1 Nucleotide(A)and amino acid sequence(B)alignment of five CYP4 genes in Frankliniella occidentalis

圖2 不同昆蟲細胞色素P450 系統發生Fig.2 Phylogenetic tree of cytochrome P450 proteins in different insect species

圖3 P450 基因在西花薊馬敏感和抗性品系中的表達分析Fig.3 The relative expression levels of P450 genes in susceptible and abamectin resistant strain of Frankliniella occidentalis

3 結論與討論

多功能氧化酶是昆蟲體內重要的解毒酶系，在對外源化合物的解毒代謝和殺蟲劑抗性機制中起著重要作用(邱星輝等，2003;Li et al.，2007)。Immaraju 等(1992)首次報道了美國加州4個西花薊馬溫室種群對氯菊酯的抗性可能與多功能氧化酶有關，在LC50和LC90水平上胡椒基丁醚(PBO)對氯菊酯的增效倍數分別達到2.7-20.0和8.3-50.2 倍。Espinosa 等(2005)研究發現，PBO 對伐蟲脒、滅蟲威、氟丙菊酯、溴氰菊酯和甲胺磷等西花薊馬抗性選育種群分別具4.6、3.3、92.6、12.5 和14.3 倍的增效作用。Thalavaisundaram等(2008)研究發現，PBO 對2個對氟胺氰菊酯產生高水平抗性的澳大利亞西花薊馬田間種群的增效倍數分別達到266 和790 倍。王圣印等(2011)測定了西花薊馬抗吡蟲啉品系中多功能氧化酶3個組分的含量以及活性，發現在抗性品系中，細胞色素P450 含量是敏感品系的4.5 倍，細胞色素b5含量是敏感品系的4.23 倍，甲氧試鹵靈-O-脫甲基酶(MROD)活性是敏感品系的5.99 倍，表明多功能氧化酶在西花薊馬對吡蟲啉的抗性中發揮著重要作用。最近，Cifuentes 等(2012)通過實時熒光定量PCR 研究發現，與敏感品系相比，抗性指數達932 倍的抗氟丙菊酯西花薊馬品系二齡若蟲和成蟲中CYP6EB1 和CYP6EC1均過量表達，說明CYP6EB1 和CYP6EC1 可能與西花薊馬對氟丙菊酯抗性有關。這些研究表明，多功能氧化酶代謝活性的增強可能是西花薊馬對多種殺蟲劑產生抗性的共同機制。

阿維菌素是由土壤中灰色鏈霉菌Streptomyces avermitilis 發酵產生的十六元大環內酯化合物，是高效廣譜殺蟲殺螨劑，主要作用于γ-氨基丁酸受體和谷氨酸門控氯離子通道。Pu 等(2010)利用增效試驗和解毒酶活性測定對一個具有23670 倍抗性的阿維菌素抗性選育小菜蛾品系(TH-Abm)的研究發現，多功能氧化酶活性提高是TH-Abm 品系對阿維菌素產生高水平抗性的重要機制。對煙粉虱的研究也發現多功能氧化酶與阿維菌素抗性相關(Wang et al.，2007)。最 近，Chen 等(2011)以西花薊馬敏感品系和對阿維菌素具有45.5 倍的西花薊馬抗性品系為材料，通過增效實驗研究發現，酯酶抑制劑脫葉磷(DEF)、谷胱甘肽S-轉移酶抑制劑馬來酸二乙酯(DEM)和PBO對西花薊馬相對敏感品系的增效倍數分別為0.77、0.84 和1.19 倍，對抗性品系的增效倍數分別為0.97、0.93 和3.00 倍，表明西花薊馬對阿維菌素的抗性可能與多功能氧化酶活性提高有關。進一步測定了敏感品系和抗性品系這3種解毒酶活性，發現相對于敏感品系，抗性品系多功能氧化酶活性提高了6.66 倍，但酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性沒有顯著差異。本文在此基礎上通過RT-PCR 獲得了5個屬于CYP4 家族的西花薊馬細胞色素P450 酶基因cDNA 片段，對這5個CYP4 基因的熒光定量PCR 分析發現，阿維菌素抗性品系CYP4-1、CYP4-2 和CYP4-5 基因的mRNA 表達水平顯著高于敏感品系，相對表達倍數分別為敏感品系的3.50、4.00 和2.48 倍，表明西花薊馬對阿維菌素的抗性可能與這3個P450 基因的過量表達相關。

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