液相色譜-質譜聯用法測定乳品中維生素D3質量濃度

謝玉珊，謝守新，宋陽，金夢,王金花，李小林，梁庭煒，林海丹，鄒志飛

（1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣州510623；2.北京出入境檢驗檢疫局技術中心,北京100026）

0 引言

維生素D是一種脂溶性維生素，目前已知的維生素D至少有10種，但最重要的是維生素D2和維生素D3。維生素D對健康的意義被廣泛的認知。我國GB 14880-2012[1]將其列為營養強化劑,乳品中通常只添加維生素D3。

目前，國內外維生素D檢測的傳統方法是液相色譜法，如我國國家標準方法[2]。近年來，選擇性強、靈敏度高的液相色譜-質譜法[3]已有應用于維生素D檢測的報道。液相色譜-質譜法檢測的選擇性好，靈敏度高，操作簡便，較好滿足含量低的嬰幼兒乳品中維生素D的測定。

本研究采用液相色譜串聯質譜法對嬰幼兒乳品中維生素D3測定進行研究，采用同位素內標法，同時優化了樣品的前處理。方法簡便，準確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（HPLC級），正己烷，乙醇，無水硫酸鈉，氯化鈉，氫氧化鉀，抗壞血酸，維生素D3，氘代維生素D3標準品（Vitamin D3-2[H]2），純度≥99%）。

維生素D3標準儲備液（質量濃度100 μg/mL）：精密稱取10 mg（精確至0.1 mg）維生素D3，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。

氘代維生素D3標準儲備液（質量濃度500 μg/mL）：精密稱取5 mg（精確至0.1 mg）氘代維生素D3標準品，用乙醇溶解并定容于10 mL棕色容量瓶中。

氘代維生素D3標準工作液（質量濃度1.00 μg/mL）：量取0.100 mL的氘代維生素D3標準儲備液（500 μg/mL），用乙醇定容至50 mL。

1.2 儀器與設備

AB 4000QTRAP串聯質譜儀，島津液相色譜儀(四元低壓梯度輸液泵,自動進樣器,柱溫箱)，電噴霧離子源，Valco二位流路切換閥，AB公司Analyst儀器控制及數據處理軟件，分析天平，水浴振蕩器，Sigma 3-16PK離心機，IKA MS 3渦旋振蕩器，Mill-Q超純水器，氮吹儀，分液漏斗，三角錐瓶，比色管，吹氮管。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于250 mL三角瓶中，加入1 g維生素C，用45～50℃的水使其溶解，再加入30 mL乙醇、15 mL質量分數為50%氫氧化鉀溶液，混合均勻后充氮，蓋上瓶蓋，置于85℃水浴振蕩中皂化40～50 min，取出立即水流冷卻至室溫。

用少量飽和氯化鈉溶液將上述皂化液全部轉入250 mL分液漏斗中，加入40 mL正己烷，輕輕搖動，排氣后蓋好瓶塞，劇烈振蕩提取，靜置分層，收集正己烷層，按上述方法用正己烷30 mL×2次萃取提取，合并正己烷溶液并用飽和氯化鈉溶液洗至近中性，收集正己烷層定容至100 mL，加入無水硫酸鈉振搖脫水，量取5.00 mL，加入100 μL氘代維生素D3標準工作液，于45℃氮氣吹干，乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，經0.45 μm有機相濾膜過濾后，供液相色譜質譜測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為YMC C18柱（50 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相為甲醇(A)-5 mmol/L甲酸銨(B)，0～4 min,A為85%～100%；4～7 min,A為100%；7.01～10 min,A為85%；流速為0.35 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為10 μL。

1.3.3 質譜條件

2 結果與討論

表1 正TurboIonspray電離源（ESI）的各參數

表2 多反應選擇離子監測方式(MRM)的各參數

2.1 樣品前處理方法的優化

乳品中維生素D是脂溶性的，經典方法采用乙醇-氫氧化鉀溶液皂化，本方法改進了國標法，方法更加簡便實用。改進如下：減少稱樣量，原來10 g，修改為5 g，原方法加抗壞血酸乙醇溶液，改為直接加固體抗壞血酸，減少體系的溶劑體積，這樣有利于下一步于振蕩器中振搖皂化時振動充分，且不會濺出。振蕩皂化時使用的三角錐瓶的瓶塞的氣密性很重要，改用了聚四氟乙烯瓶塞，確保振搖皂化時瓶塞不會松脫，避免了空氣帶入造成維生素的氧化損失，從而使回收率穩定。本方法提高了皂化溫度，實驗表明溫度提高至85℃，不影響維生素D3回收率，而油脂皂化更加徹底，有利于下一步的萃取凈化和儀器分析。改用正己烷替代石油醚，使萃取分層更加明顯，減少乳化。采用氮氣吹干部分萃取液，因為液相色譜質譜法靈敏度比原國標法液相色譜法高許多，因此只需采用部分萃取液吹干后，定容分析已滿足檢測要求，既減少試劑損耗又縮短實驗時間。在吹干前加入內標物，既校正了氮氣吹掃時維生素的損失又能有效校正質譜分析時的基質效應。

2.2 質譜條件的優化

蠕動泵以10 μL/min的流速連續注射質量濃度為0.1 mg/L的維生素D3標準溶液入TurboIonspray電離源中，在正離子檢測方式下對維生素D3進行一級質譜分析（Q1掃描），得到分子離子峰，對各準分子離子峰進行二級質譜分析（子離子掃描），得到碎片離子信息，維生素D3二級質譜見圖1。由此確定定性用的各離子對。采用MRM模式采集數據，選擇駐留時間為100 ms,優化各離子對的去簇電壓（DP），碰撞氣能量（CE），入口電壓(EP)，碰撞池出口電壓(CXP)。

采用“T”三通方式，即蠕動泵以10 μL/min的流速連續注射0.1mg/L的維生素D3標準溶液，流動相則以350 μL/min的流速與維生素D3標準溶液混合后進入離子源來進行優化色譜流動相合離子源氣體的各參數。當分別用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-5 mmol/L甲酸銨，甲酸銨的相應值相對較高，采用乙腈代替甲醇，相應值沒有明顯變化。因此選用甲醇-5 mmol/L甲酸銨作為流動相，

靈敏度足以滿足要求。

圖1 維生素D3的子離子全掃描色譜

2.3 色譜條件的優化

經質譜條件篩選后選用甲醇-5 mmol/L甲酸銨溶液作為流動相，考察其色譜行為，維生素D3的峰形理想，對樣液進行分析，試驗梯度洗脫條件，確定最佳的洗脫梯度，標準和樣品的維生素D3及其內標的多反應監測離子圖如圖2所示。

圖2 標準和樣品的維生素D3及其內標的MRM（多反應監測離子圖）

2.4 線性范圍

用乙腈配成的一系列質量濃度的標準混合工作溶液按實驗的儀器條件進行測定，以分析物與內標物峰面積比(Y)-分析物與內標物質量濃度比(X)作校正曲線，得到線性回歸方程y=1.55×104x+7.83×103，維生素D3在0～50 μg/L范圍內線性關系良好（相關系數為0.9999），相關系數均大于0.99，結果如表3所示。

2.5 回收率、精密度及定量限

采用本方法在嬰幼兒奶粉中添加維生素D3標準溶液，按方法進行回收率實驗，每個添加濃度重復測定6次，計算添加平均回收率和相對標準偏差，結果見表3。奶粉中維生素D3的平均回收率在83.9%～93.0%之間,變異系數為1.10%～4.90%,方法的準確度和精密度均符合殘留分析要求。實驗表明樣品中維生素D3在添加20 μg/kg水平時，信噪比（S/N）大于10，且回收率和精密度滿意，因此以20 μg/kg作為方法的定量限。

表3 奶粉中維生素D3的添加回收率和精密度(n=6)

2.6 實際樣品分析

采用本方法對經多個實驗室比對標定維生素D3的奶粉質控樣品進行測定，重復測定6次，平均測定值為82.1 μg/kg，變異系數為5.10%，結果在質控的警戒控制線（72.3～97.0 μg/kg）內。

3 結束語

本方法研究建立了乳品中維生素D3的高效液相色譜質譜聯用法。方法的樣品的前處理簡單、易操作、定量準確，適用于乳品中維生素D3的檢測。與國標法比較，儀器的靈敏度提高了，不需采用半制備色譜的方法可以達到檢測的要求，減少試劑的消耗和縮短了檢測時間，同時質譜法的定性的準確性高。與其它同類方法比，采用同位素內標定量，有效降低基質效應，定量更為準確。

[1]GB 14880-2012《食品安全國家標準食品營養強化劑使用標準》[S].

[2]GB 5413.9-2010嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定[S]

[3]黃芳,吳惠勤,杭義萍.高效液相色譜-串聯質譜法測定食品中維生素D2 和維生素D3[J].理化檢驗：化學分冊，2011，47（5），577-579，582.