羅伊氏乳桿菌體外抑菌和免疫調節性能的研究

池海波，李燁

（江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

0 引言

乳桿菌類乳酸菌是益生菌的重要類群，能通過生物拮抗和免疫調節作用抑制病原菌在機體內定植、繁殖以及致病能力。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）天然存在于人體和動物體腸道內，具有抑制病原菌、調節機體腸道微生物菌群的平衡、增強機體免疫力等生理活性和保健功能[1]，是國際上公認的新型益生乳酸菌，具有很高的理論研究和應用價值。

為了深入探究羅伊氏乳桿菌的抑菌和免疫調節性能，本文以L.reuteri ATCC53608為研究對象，3株分離自發酵乳制品的益生乳酸桿菌為比對，研究并比較了羅伊氏乳桿菌不同培養的上清液對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌4種指示菌的體外抑菌性能，以小鼠巨噬細胞系RAW264.7為細胞模型，研究羅伊氏乳桿菌對脂多糖誘導的免疫反應的調節性能，為羅伊氏乳桿菌益生性能的的開發和應用提供理論依據。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和細胞

羅伊氏乳桿菌ATCC53608（Lactobacillus reuteri ATCC53608）、嗜酸乳桿菌 237（Lactobacillus acidophilus 237）、嗜酸乳桿菌234（Lactobacillus acidophilus 234）、植物乳桿菌 233（Lactobacillus plantarum 233）、大腸桿菌（Escherichia coli W3110）、金黃色葡萄球菌ATCC25923（Staphylococcus aureus ATCC25923）、阪崎克羅諾桿菌BAA-894（Cronobacter sakazakii BAA-894）、單增李斯特菌CMCC54005（Listeria monocytogenes CMCC54005）均為本實驗室保存，其中嗜酸乳桿菌237、嗜酸乳桿菌234、植物乳桿菌233分離自發酵乳制品，小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 培養基

羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌的培養基為MRS，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌、單增李斯特菌培養基為LB，小鼠巨噬細胞系RAW264.7培養液為DMEM（Gibco BRL,USA），并添加10%胎牛血清（Hyclone Logan,UT,USA）、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）。

1.1.3 實驗器材

牛津杯內徑（6.0±0.1）mm,外徑（7.8±0.1）mm,高（10.0±0.1）mm ；Delta 320 pH 計，GHP-9080隔水式恒溫培養箱，MLS-3750高溫滅菌鍋，THZ-C-1全溫振蕩器，ST-16R臺式高速冷凍離心機，Elx800酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌MRS培養的無菌上清液的制備和處理

將4種乳酸桿菌分別以體積分數為1%的接種量轉接于MRS液體培養基中，37℃靜置培養24 h后10 000 r/min離心10 min，收集上清，過濾除菌后測上清液pH，將上清液分為3組，一組為上清原液，第二組上清液進行加熱煮沸15 min處理，第三組上清液用濃度為4 mol/L的NaOH溶液調pH值至7.0，各組上清液4℃貯存備用。

1.2.2 羅伊氏乳桿菌甘油發酵的無菌上清液的制備和處理

將羅伊氏乳桿菌以體積分數為1%的接種量轉接于MRS液體培養基中，37℃靜置培養24 h，10 000 r/min下離心10 min，上清過濾備用并收集菌體，用0.05 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH=7.2）洗滌菌體兩次，洗滌后的菌體用磷酸鉀緩沖液制成菌懸液（菌體濃度1.0×108mL-1），再加入等體積的濃度為0.4 mol/L的甘油，37℃靜置培養2～6 h。分別在培養2 h和6 h時離心收集上清，過濾除菌后，一部分上清液4℃貯存備用，另一部分上清液進行加熱煮沸15 min處理后4℃貯存備用。

1.2.3 指示菌菌懸液的制備

將4種指示菌分別轉接于LB培養液，37℃振蕩培養18 h，用無菌生理鹽水將菌液濃度稀釋至OD600=1.0，待涂布用。

1.2.4 抑菌試驗

采用牛津杯法[2]。將制備好的指示菌菌懸液100 μL均勻涂布于LB平板,待平板表面自然干燥后,立即將滅菌牛津杯放置在平板上,取200 μL待測液加入牛津杯中，37℃培養18 h，每個樣品做3個平行，測量抑菌圈直徑（mm），拍照。

1.2.5 細胞免疫反應實驗

小鼠巨噬細胞系RAW264.7用DMEM高糖培養液培養，并添加體積分數為10%熱滅活（56℃，30 min）胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL），于CO2培養箱中，37℃培養[3]。采用0.25%胰酶消化細胞，細胞計數后，將200 μL細胞懸液接種至96孔細胞培養板，每孔1.0×105個細胞，培養12 h后更換新鮮培養液，同時加入終質量濃度1 mg/L LPS（E.coli，sigma-Aldrich）和不同終濃度（5×106，5×107，5×108mL-1）的羅伊氏乳桿菌菌液，24 h后取細胞培養上清液離心，去除殘余細胞，采用ELISA試劑盒（eBioscience,USA）測定細胞上清液中白細胞介素-6（IL-6）濃度。

2 結果與討論

2.1 無菌上清液的抑菌作用

已經報道羅伊氏乳桿菌具有廣譜的抑菌性能[4]，羅伊氏乳桿菌拮抗病原菌的機制之一是能厭氧代謝甘油產非蛋白類的廣譜抗菌物質——羅伊氏菌素（Reuterin）[5]，Reuterin化學本質是在甘油脫水酶和輔酶維生素B12的作用下[6]，甘油脫水代謝的產物3-羥基丙醛（3-HPA）的單體、3-羥基丙醛的水合物和3-羥基丙醛的環化二聚體的混合體系[7-8]。

本研究著重考察了在無添加甘油、用MRS培養的條件下和在甘油中發酵的條件下，羅伊氏乳桿菌ATCC53608對大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌4種指示菌的抑制性能以及其抑菌活性物質的產生和作用特性。

乳酸桿菌用MRS培養的無菌上清液對4種指示菌的抑菌作用如圖1所示。

圖1 4種乳酸桿菌MRS培養的無菌上清原液對指示菌的抑菌作用

由圖1可以看出，對羅伊氏乳桿菌MRS培養的無菌上清液最敏感的指示菌是大腸桿菌，最不敏感的是金黃色葡萄球菌。與其它乳酸菌比較，羅伊氏乳桿菌MRS培養的無菌上清原液對4種指示菌的抑制效果，相似于嗜酸乳桿菌234及嗜酸乳桿菌237，但次于植物乳桿菌233。

2.2 pH值對上清液抑菌作用的影響

本研究中測得的4種乳酸菌的上清原液的pH值分別是：植物乳桿菌233為2.5，嗜酸乳桿菌234為3，嗜酸乳桿菌237為3.5，羅伊氏乳桿菌為3.5，將上清原液的pH值調至7.0后，4種乳酸菌在4種指示菌的平板上均沒有了抑菌現象，圖2顯示了上清原液的pH調至中性后對金黃色葡萄球菌的作用結果。該實驗結果說明在MRS培養的乳酸桿菌上清液中，酸是主要的抑菌成分。

圖2中，（a）為上清原液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈；（b）為pH值調至7.0的上清原液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈；233為植物乳桿菌；234為嗜酸乳桿菌；237為嗜酸乳桿菌；LR為羅伊氏乳桿菌ATCC53608。

圖2 pH值對4種乳酸桿菌MRS培養的上清液抑菌作用的影響

2.3 加熱處理對上清液抑菌作用的影響

對部分羅伊氏乳桿菌MRS培養的上清原液進行了加熱煮沸處理，比較加熱處理前后上清原液對致病菌的抑菌作用。

表1 羅伊氏乳桿菌MRS培養上清加熱煮沸處理前后的抑菌圈直徑 mm

由表1可以看出，加熱后抑菌圈的直徑下降并不明顯，說明羅伊氏乳桿菌MRS培養的上清液中的抑菌組分有較好的熱穩定性，排除大分子蛋白質作為抑菌物質的可能。

2.4 羅伊氏乳桿菌在甘油中發酵的上清液的抑菌作用

羅伊氏乳桿菌的益生功能與代謝甘油產羅伊氏菌素密切有關，基于羅伊氏菌素合成代謝的途徑，采用兩次發酵處理法考察了羅伊氏乳桿菌ATCC53608產生羅伊氏菌素及其抑菌的性能。首先用MRS培養基培養菌體，離心并過濾獲得一次發酵上清液，菌體洗滌后添加甘油靜置培養2～6 h，離心并過濾獲得二次發酵上清液，分別考察了二次發酵2 h和6 h后的抑菌性能，同時也考察了對甘油二次發酵的上清液進行加熱煮沸處理后的抑菌性能變化，結果如圖3所示。

圖3 羅伊氏乳桿菌在甘油中發酵的上清液的抑菌作用

由圖3可以得出，羅伊氏乳桿菌添加甘油二次發酵的上清液，無論是原液還是加熱煮沸處理液，對4種指示菌的的抑菌性能較一次發酵上清液都有明顯提高，特別對革蘭氏陽性指示菌金黃色葡萄球菌，二次發酵2 h的上清原液抑菌圈直徑提高40 mm。比較加熱處理前、后的抑菌性變化，可見添加甘油二次發酵液經過加熱煮沸處理后，對4種指示菌抑菌圈直徑比二次發酵原液都有明顯增加。其機制有待于進一步研究，推測可能與羅伊氏菌素是一個以3-羥基丙醛單體為轉換中心的復雜的動態混合體系、其成分包括3-羥基丙醛、3-羥基丙醛水合物及3-羥基丙醛的二聚體有關，經過加熱處理，其本身的混合體系成分或比例發生了改變，導致其抑菌性增強。本實驗結果還顯示了二次發酵2 h的上清液抑菌能力好于6 h的發酵上清液，即甘油發酵液隨著發酵時間的延長，其抑菌性能下降，推測可能也是與混合體系成分發生了改變有關。

2.5 羅伊氏乳桿菌對LPS誘導的細胞免疫反應的影響

乳酸菌對非特異性免疫的調節主要是通過影響單核巨噬細胞的免疫功能而實現，國內外的研究表明，乳酸菌可抑制細胞分泌炎性細胞因子[9-10]。革蘭氏陰性細菌外膜成分脂多糖（LPS）又稱內毒素，是非特異性免疫刺激劑，其類脂A（lipid A）結構能被免疫細胞（單核巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）表面的病原體識別受體TLR4（Toll-like receptor 4）識別，激活胞內信號轉導途徑，引發TNF-α，IL-1，IL-6等炎性細胞因子的釋放，過量的細胞因子會導致毒性效應[11-12]。

本研究以LPS（1 μg/mL）作為免疫誘導劑，以巨噬細胞RAW264.7為細胞模型，考察了羅伊氏乳桿菌的免疫調節作用。在LPS刺激巨噬細胞RAW264.7的免疫反應體系中同時加入羅伊氏乳桿菌菌液，誘導24 h后檢測細胞培養上清液中IL-6質量濃度，結果如圖4所示。

圖4 羅伊氏乳桿菌對LPS誘導RAW264.7細胞合成IL-6的影響

圖4中，A為質量濃度1 μg/mL的LPS誘導；B為質量濃度1 μg/mL的LPS誘導，羅伊氏乳桿菌初始菌濃為106mL-1；C為質量濃度1 μg/mL 的LPS誘導，羅伊氏乳桿菌初始菌濃為107mL-1；D為質量濃度1 μg/mL的LPS誘導，羅伊氏乳桿菌初始菌濃為108mL-1。

由圖4可以看出，與對照組相比，與羅伊氏乳桿菌ATCC53608共孵育時，RAW264.7細胞的IL-6合成量明顯下降（IL-6量最低降為8 pg/mL），且隨著共培養體系中羅伊氏乳桿菌ATCC53608數量增多IL-6合成量下降越明顯，可見羅伊氏乳桿菌ATCC53608對LPS刺激的免疫反應有較強的調節能力。

3 結論

利用甘油發酵是羅伊氏乳桿菌在體外呈現較強抑菌性能的重要條件，單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌4種指示菌中，金黃色葡萄球菌對其抑菌成分最敏感，加熱處理甘油發酵上清液能夠增強抑菌效果，羅伊氏乳桿菌對LPS刺激的免疫反應具有調節作用。由于羅伊氏菌素抑菌作用機制以及乳酸菌抑制炎性細胞因子的分子機理目前還沒有被闡明，所以本研究發現的一些實驗現象有待于今后深入探析。

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