高效液相色譜法測定牛奶中十二種磺胺類藥物殘留

王偉，張鵬飛,王丹慧，李梅，于鳳玲，薛峰

（1.內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司，呼和浩特011500；2.包頭市青山區興勝鎮政府，內蒙古 包頭 014030）

0 引言

牛奶檢測中經常出現抗生素陽性的現象，尤其是磺胺類抗生素，目前，牛奶中磺胺類檢測國標方法只有液相色譜-質譜連用，價格昂貴，且操作復雜，無法大范圍推廣，GB 29694-2013《食品安全國家標準動物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》中檢驗方法適用于肌肉和肝臟組織的檢測，不適用于牛奶中磺胺類藥物殘留的檢測，因牛奶基質與肌肉、肝臟不同，導致使用乙酸乙酯進行提取，回收率太低，無法滿足要求，因此，進行液相方法的研究，使用乙腈提取，旋蒸，轉換溶劑，除脂，固相萃取，液相-紫外檢測。實驗方法操作簡單，滿足相關國標要求，且大部分企業均可滿足實驗條件，可實現廣泛推廣。

1 儀器設備和耗材

液相色譜儀：配紫外檢測器。

溶劑過濾器：帶有0.45 μm水系濾膜。

天平：萬分之一天平，十萬分之一天平。

旋轉蒸發儀：配控溫裝置。

高速離心機：至少8000轉/分。

氮吹儀、漩渦混合器、固相萃取裝置。

離心管（50 mL和15 mL）、100 mL或250 mL旋蒸瓶、刻度吸管（1 mL和5 mL）、一次性塑料吸管（3 mL）、試管（15×150）、水系濾膜（0.22 μm）。

2 試劑

以下所用試劑，除特殊注明外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682規定的一級水。

磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧噠嗪、苯酰磺胺、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、磺胺二甲氧噠嗪標準品：含量≥99%；磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶標準品：含量≥98%。

乙腈：色譜純。

甲醇：色譜純。

鹽酸。

正己烷。

甲酸：色譜純。

氨水。

MCX柱：60 mg/3 mL，或相當者。

0.1 %甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水溶解并稀釋至1 000 mL。

0.1 %甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸830 mL，用乙腈溶解并稀釋至1 000 mL。

洗脫液：取氨水5 mL，用甲醇溶解并稀釋至100 mL。

0.1 mol/L鹽酸溶液：取0.83 mL，用水溶解并稀釋至100 mL。

50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50 mL，用乙腈溶解并稀釋至100 mL。

3 測定方法

3.1 樣品處理

3.1.1 稱量和溶解測試樣品

稱5 g(精確到0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混合2 min，≥8 000 r/min離心5 min，取上清液于100 mL或250 mL旋蒸瓶中，殘渣中加入乙腈20 mL，重復提取一次，合并兩次提取液。

旋蒸瓶于低于50℃下旋轉蒸發干，用0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL洗旋蒸瓶，轉至15 mL離心管中，再用0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL洗一次旋蒸瓶，轉至同一離心管中，用正己烷3 mL洗旋蒸瓶，轉至同一離心管中，重復用正己烷3 mL洗一次，轉至同一離心管中，渦旋混合30 s，大于等于8 000 r/min離心5 min，棄正己烷層，取下層液備用。

MCX柱依次用甲醇2 mL和0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL活化，取備用液過柱，控制流速1 mL/min。依次用0.1 mol/L鹽酸溶液1 mL和50%甲醇乙腈溶液2 mL淋洗，用洗脫液4 mL洗脫，收集洗脫液，于低于50℃氮氣吹干，用0.1%甲酸乙腈溶液1.0 mL溶解殘余物，濾膜過濾，供高效液相色譜測定。

注：如果在檢測過程中發現，待測樣品的濃度太高，可以將處理樣品用0.1%甲酸乙腈溶液進行稀釋，然后再進行上機檢測，在計算時需考慮稀釋倍數。

3.1.2 標準曲線制備

精密量取10 μg/mL磺胺類藥物混合標準工作液適量，用0.1%甲酸乙腈溶液稀釋，配制成濃度為0、100、200、300、400、500 μg/L的系列混合標準溶液，供高效液相色譜測定。以測得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數。

備注：可作單點或多點校準，按外標法。

3.2 儀器參考條件

柱溫箱：35℃；

紫外檢測器：270 nm；

進樣量：20 μL；

色譜柱：C18（250×4.6 mm，5 μm）或其他性能相當者；

流動相：0.1%甲酸+乙腈，梯度洗脫見表1；

流速：1.0 mL/min；

備注：以上儀器條件是參考條件，在實際操作過程中可以根據樣品特性和儀器狀態做適當調整。

3.3 檢出限

3.3.1 定性檢出限

磺胺醋酰：10 μg/kg。

磺胺吡啶：10 μg/kg。

表1 流動相梯度洗脫濃度設置

磺胺甲氧噠嗪：10 μg/kg。

苯?；前罚?0 μg/kg。

磺胺間甲氧嘧啶：10 μg/kg。

磺胺氯噠嗪：10 μg/kg。

磺胺異噁唑：10 μg/kg。

磺胺二甲氧噠嗪：10 μg/kg。

磺胺甲噁唑：10 μg/kg。

磺胺噁唑：10 μg/kg。

磺胺甲基嘧啶：10 μg/kg。

磺胺二甲基嘧啶：10 μg/kg。

3.3.2 定量檢出限

磺胺醋酰：25 μg/kg。

磺胺吡啶：25 μg/kg。

磺胺甲氧噠嗪：25 μg/kg。

苯?；前罚?5 μg/kg。

磺胺間甲氧嘧啶：25 μg/kg。

磺胺氯噠嗪：25 μg/kg。

磺胺異噁唑：25 μg/kg。

磺胺二甲氧噠嗪：25 μg/kg。

磺胺甲噁唑：25 μg/kg。

磺胺噁唑：25 μg/kg。

磺胺甲基嘧啶：25 μg/kg。

磺胺二甲基嘧啶：25 μg/kg。

4 結果

（1）標準曲線。

表2 標準曲線

12種磺胺標準曲線（0 μg/kg ，100 μg/kg，200 μg/kg，300 μg/kg，400 μg/kg，500 μg/kg），相關系數R2均大于等于0.998。

（2）回收率。

表3 牛奶中50μg/kg 12種磺胺混標加標

表4 牛奶中25 μg/kg磺胺二甲基嘧啶加標回收率及變異系數

（3）重復性。

方法規定重復性：在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不超過算數平均值的20%,檢測三組平行樣數據，結果如下。

表5 12種磺胺混標樣品的重復性

（4）精密度。

同時做6組陽性平行樣樣品，精密度數據見下表6。

表6 12種磺胺類精密度

由此可見，標準曲線、回收率、重復性、精密度都滿足GB/T 27404中相關要求。

5 討論

（1）嘗試了丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、正己烷做溶劑萃取，回收率普遍為30%-50%之間。

（2）標準曲線工作液需現用現配，磺胺甲基嘧啶標準工作液放置2天后（4℃保存），上機，明顯不呈線性。

（3）磺胺甲氧噠嗪、磺胺醋酰、磺胺吡啶可能存在干擾，如無法區分，需用標準加入法判定，或調整梯度洗脫、更改柱溫、流速等條件。

（4）樣品渦旋混合要混勻，要保證離心效果，否則旋蒸后萃取分層后，中間有大量白色物質（可能為蛋白質），可能會影響回收率。

[1]GB 29694-2013《食品安全國家標準動物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》.

[2]萬春花.磺胺類藥物殘留的色譜分析進展[J].現代科學儀器，2008（2）：1-9.

[3]GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》.