乳制品及嬰幼兒配方食品中蠟樣芽孢桿菌的快速檢測

劉新梅,程逸宇,張弛,方昕,高翔,朱榮,楊軍

(國家加工食品及食品添加劑質量監督檢驗中心(南京)，南京市產品質量監督檢驗院，南京210028)

0 引言

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種可形成芽孢的好氧革蘭氏陽性菌，極易污染食品[1]引起心內膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾病[2]。蠟樣芽孢桿菌在乳品行業中原料乳的污染較為嚴重。G riffiths在原乳中分離的83株菌中有85%是致腹瀉毒素陽性菌株[3]。

目前傳統的檢測方法主要是采用選擇性培養基分離培養，生化反應鑒定等方法，耗時費力，難以適應現代食品生產的檢驗需要[4]。近年來，國內外對于蠟樣芽孢桿菌的快速檢測開發出多種檢驗方法，如PCR檢驗[5]、蛋白印跡技術(Colony Blot Immunoassay CBI)檢驗[6]、VITEK自動生化鑒定儀檢驗[7]。本研究針對蠟樣芽孢桿菌的特異性卵磷脂-水解磷脂酶C基因(pc-plc)[8]設計引物和探針，應用Taqman實時熒光PCR技術對乳制品及嬰幼兒配方食品中的蠟樣芽孢桿菌進行快速檢測。

1 材料與方法

1.1 菌種

蠟樣芽孢桿菌標準菌株3株CMCC(B)63301、63302、63303，短小芽孢桿菌CMCC(B)63202，枯草芽孢桿菌2株ATCC6633、CMCC(B)63501。金黃色葡萄球、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌為本實驗室自行分離保存。

1.2 引物和探針

根據蠟樣芽孢桿菌pc-plc基因序列，利用Primer Express 3.0軟件分析，優化設計出引物和探針，并使用BLAST程序進行同源性比對，保證引物和探針與靶基因結合的高度特異性。引物和探針由南京金斯瑞生物公司合成。上游引物：5’-AAAGATTGGTTCGTGAGAGC-3’；下游引物：5’-CGCTTACCTGTCATTGGTG-3’；探針：5’FAM-ACAAGAATATGCAGATAAATGGCGCGCTG-3’TAMRA，擴增條帶大小163 bp。

1.3 實驗試劑

細菌DNA提取試劑盒，Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，營養肉湯，MYP培養基。

1.4 食品樣本

巴氏殺菌奶、酸奶、嬰兒奶粉、嬰兒米粉，均從本地市場購入。

1.5 儀器設備

ABI 7500FAST實時熒光PCR儀、ABI普通PCR儀、電泳儀、生物安全柜、離心機

1.6 實時熒光PCR反應體系的建立

蠟樣芽孢桿菌標準菌株活化后，加入10 mL營養肉湯，37℃培養16 h，取1mL菌液使用細菌DNA提取試劑盒提取DNA，作為PCR反應模板DNA。PCR反應體系：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)12.5 μL，引物各0.5 μL，探針1 μL，模板DNA5 μL，無菌水補足25 μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性5 s，58 ℃退火40 s，進行40個循環，檢測Ct值。

1.7 實時熒光PCR檢測特異性

選取與蠟樣芽孢桿菌親緣關系較近的短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及常見致病菌金黃色葡萄球、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌，活化菌種，37℃營養肉湯培養16 h，分別提取DNA，進行實時熒光PCR檢測,測定該檢測方法的特異性。

1.8 實時熒光PCR檢測靈敏度

將蠟樣芽孢桿菌接種在營養肉湯中37℃培養16 h，菌液梯度稀釋，接種到MYP培養基測定菌落數，提取各稀釋度菌液DNA為模板，測定實時熒光PCR靈敏度。再以上述菌液DNA為模板，進行普通PCR，引物與實時熒光PCR相同，反應條件為：95℃預變性3 min，95 ℃ 變性5 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。PCR結果通過0.8%瓊脂糖電泳檢測，與實時熒光PCR結果相比較。

1.9 人工污染食品檢測

取1 mL，37℃營養肉湯培養16 h的蠟樣芽孢桿菌菌液，加到10 g巴氏殺菌奶、酸奶、嬰兒奶粉、嬰兒米粉（嬰兒奶粉、嬰兒米粉為1∶10水溶解液）中37℃孵育10 min，梯度稀釋，分別提取DNA，進行實時熒光PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR反應體系的建立和特異性

分別用蠟樣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球、沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌對所設計pc-plc基因引物和探針進行特異性檢測。結果表明，該探針和引物對蠟樣芽孢桿菌具有較好的特異性，只有蠟樣芽孢桿菌能產生特異擴增曲線(圖1)。本研究檢測了3株蠟樣芽孢桿菌標準菌株，均能作為PCR反應模板，平均Ct值為22.67，24.33，23.63。

2.2 引物和探針的靈敏度

以1 mL計數過的不同濃度蠟樣芽孢桿菌菌液為模板，提取DNA，進行實時熒光PCR檢測，以測定其靈敏度。實驗結果如圖2所示。圖2中，從左往右依次為1.5×107，1.5× 106，1.5×105，1.5× 104，1.5× 103，150 g-1菌液所得擴增曲線。高于150 g-1的菌液濃度均能被實時熒光PCR所擴增，Ct值隨著模板DNA濃度的下降而上升,Ct值最低為24.79(1.5×107g-1），Ct值最高為36.88(150 g-1)。根據實驗結果繪制標準曲線(圖3)，可以看出Ct值和菌液濃度之間具有明顯的線性關系，R2=0.9852。實驗表明，利用pc-plc基因引物和探針對蠟樣芽孢桿菌的檢測靈敏度可以達到1.5×102g-1。普通PCR結果如圖4所示，1.5×103mL-1濃度以上的菌液作為模板均能擴增出100～200 bp之間條帶，且條帶的亮度由亮到暗，與實時熒光PCR實驗結果Ct值變化趨勢相吻合；150 g-1濃度則沒有條帶顯示，表明實時熒光PCR的靈敏度要比普通PCR高一個數量級。

圖1 蠟樣芽孢桿菌實時熒光PCR曲線

圖2 不同濃度蠟樣芽孢桿菌實時熒光PCR反應曲線

圖3 蠟樣芽孢桿菌實時熒光PCR反應標準曲線

圖4 不同濃度蠟樣芽孢桿菌普通PCR反應

2.3 人工污染實驗結果

實驗結果如表1所示。表1中，在巴氏殺菌奶、酸奶、嬰兒奶粉、嬰兒米粉等4種人工污染食品中，嬰兒米粉中含有200 g-1的蠟樣芽孢桿菌就能被檢測出來，Ct值為34.22±0.27，與靈敏度實驗結果相似。而在3種乳制品中蠟樣芽孢桿菌含量達到103CFU/g以上才能被檢測到，Ct值分別為31.87±0.82，33.49±0.74，33.12±0.43，這可能是因為乳制品成分比較復雜，干擾了DNA提取或PCR反應，從而使得檢驗靈敏度偏低。

表1 人工污染實驗

3 結論

由于蠟樣芽孢桿菌及其芽孢廣泛存在于周圍的環境中，極易污染食物而引起食物中毒，因此需要發展一種快速的檢測方法，對食品加工過程進行質量控制，以提高食品的安全性。目前對蠟樣芽孢桿菌的檢測主要采用傳統的細菌分離及生化鑒定方法，費時、費力，需要較長時間進行選擇性增菌過程[9]。本研究結果表明，以特異性卵磷脂-水解磷脂酶C基因(pc-plc)為目的基因設計引物建立的Taqman實時熒光PCR檢測方法能特異性擴增蠟樣芽孢桿菌，且與其他的芽胞桿菌及其他常見致病菌株均無交叉反應，可特異地檢測蠟樣芽孢桿菌，檢測敏感性可達150 g-1。熒光PCR反應得到的Ct值與菌液濃度之間呈很好的線性關系，可以通過建立標準曲線來進行定量測定。人工污染實驗也表明，該方法可以用來快速測定乳制品及嬰幼兒配方食品中的蠟樣芽孢桿菌，在嬰幼兒米粉中檢測靈敏度為200 g-1，而在乳制品中檢驗靈敏度要低于嬰兒米粉，檢出限只能達到103g-1。這可能是由于乳制品成分復雜，其中含有的某些物質對DNA的提取及PCR反應產生了一定干擾造成的。我們希望能在以后的實驗中對此問題展開進一步的研究，通過濾膜富集等方法降低乳制品對檢測的干擾，提高本方法對乳制品中蠟樣芽孢桿菌的檢出限。

[1]HIROSHI F,YOSHIE T,RYOTARO S.Duplex Real-time SYBR Green PCR assays for detection of 17 species of food or waterborne pathogens in stools.J Clinical Microbial[J],2003,41(11):5134.

[2]FINLAY W J J,LOGAN N A,SUTHERLAND A D.Bacillus cereus produces most emetic toxin at lower temperatures[J].Lett Appl Microbiol,2000(31):385-389.

[3]GRIFFTHS M W.Toxin production by psychrotrophic Bacillus spp.present in milky[J].Food Protect,1990,53(9):790-792.

[4]趙寧，呂琦，姚麗燕，等.原料乳中蠟樣芽孢桿菌的快速檢測[J].中國乳品工業，2009，37（9）：43-45.

[5]MANTYNEN V,LINDSTROM K.A rapid PCR一Based DNA test for enterotoxic Bacillus cereus[J].Appl Environ Microb,1998,64(5):1634-1639.

[6]CHIHUA C,HWIACHENG D.A colony blot immunoassay for the rapid identification of Bacillus cereus[J].J Food Protect,2004,67(2):387-390.

[7]黃訓端，潘見，余曉峰.草毒中蠟樣芽抱桿菌的VITEK快速檢測[J].微生物學雜志，2006.26(4):99-102.

[8]MANINEZ-BLANCH J F，SANCHEZ G，GARAY E，et al.Detection and quantification of viable Bacillus cereus in food by RT-qPCR[J].European Food Research and Technology，2011，232(6):951-955.

[9]中國疾病預防控制中心營養與食品安全所.GB/T 4789.14-2003蠟樣芽抱桿菌檢驗[S].