五株乳桿菌益生特性及降脂性能研究

王霄鵬，呂嘉櫪，閆亞梅，李文娟，杜冰

（陜西科技大學食品與生物工程學院,西安710021）

0 引言

發(fā)酵食品是一類利用微生物發(fā)酵制得的產品，在中國有著悠久的歷史和豐富的文化內涵[1]。現代科學研究表明：傳統(tǒng)發(fā)酵食品不僅具有較高的營養(yǎng)價值和獨特的口感風味，還含有很多活性成分，使發(fā)酵食品具有一定的保健功能，如降血脂、調節(jié)腸道微環(huán)境、降血糖及提高免疫力等[2-4]。益生菌本身具有很多對人體有益的功效[5]。

本研究從西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬和乳品中分離篩選出5種乳桿菌，分別為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）主要針對降脂性能以及降脂機制研究其益生功能，加強乳桿菌及發(fā)酵食品的功能性，為乳桿菌的進一步開發(fā)利用提供一定的理論依據。

1 實驗

1.1 菌株與試劑

從西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬和乳品中分離篩選出的嗜酸乳桿菌（LA），保加利亞乳桿菌（LB），干酪乳桿菌（LC），植物乳桿菌（LP），鼠李糖乳桿菌（LGG），由陜西科技大學食品與生物工程學院提供。膽固醇，蔗糖酯，膽固醇試劑盒和甘油三酯試劑盒，冰醋酸（分析純），無水乙醇，豬油（自制），豬膽鹽。

1.2 儀器與設備

B203LEDR生物顯微鏡，AC-0629普通光學顯微鏡，單人凈化工作臺，XW.80A旋渦混合器，DHP9080電熱恒溫培養(yǎng)箱，LS-C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，分光光度計，冷凍離心機，pH計。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，檸檬酸二胺2 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，Tween-80 1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.0，在121℃滅菌20 min。

膽固醇（TC）培養(yǎng)基：準確稱量0.1 g膽固醇于小燒杯，加入1 mL Tween-80，0.1 g蔗糖酯，攪拌均勻后加入5.0 mL冰乙酸，邊加熱邊攪拌至充分溶解，超聲處理15 min后再加入MRS培養(yǎng)基中，邊加邊攪拌，使膽固醇質量濃度為0.1 g/L，然后加入0.2%巰基乙酸鈉，調pH值為6.0，121℃滅菌15 min。

甘油三酯（TG）培養(yǎng)基：將Tween-80與豬油按1∶5比例混合，邊加熱邊攪拌至充分溶解，保溫5 min后乳化，得到甘油三酯膠束。將6%的比例將甘油三酯膠束加入MRS培養(yǎng)基中，邊加邊攪拌，然后加入0.2%巰基乙酸鈉，調pH值為6.0，121℃滅菌15 min。

1.4 方法

1.4.1 菌株的活化

將五株乳桿菌按體積分數為1%的比例接種到滅完菌的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，按相同的步驟再重復活化一次，備用。

1.4.2 菌株最適溫度的測定

將活化好的菌株按1%的比例接種到MRS培養(yǎng)基中，分別在33，35，37，39，41，43 ℃下培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基作為對照，用分光光度計在600 nm處測量OD值。

1.4.3 菌株最適pH值的測定

配制好培養(yǎng)基后分別將pH值調至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，將5種菌按1%的量接種到調好pH值的MRS培養(yǎng)基中，在最適溫度處培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基作為對照，用分光光度計在600 nm處測量OD值。

1.4.4 菌株生長曲線及產酸性能的測定

將活化好的菌株按1%的比例接種到MRS培養(yǎng)基中，最適溫度下培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基作為對照，每隔2 h測量OD600值和pH值。

1.4.5 菌株對人工胃液的耐受能力

將質量分數0.2%的NaCl和0.35%胃蛋白酶加入燒杯中，用濃度為1 mol/L的HCL調整pH值為3.0后，使用0.22 μm的過濾器過濾除菌后備用。將活化好的菌種培養(yǎng)液離心，收集菌體，加入生理鹽水，使用漩渦混合器制菌懸液后以1∶9的比例與人工胃液混合，最適溫度下孵育3 h，以未孵育的菌種為對照，使用高層瓊脂柱法計數，計算菌種存活率，即

1.4.6 菌株對膽鹽的耐受能力

將不同濃度的豬膽鹽加入到MRS培養(yǎng)基中，按1%的量接種后最適溫度下培養(yǎng)48 h，以未加入膽鹽的培養(yǎng)基作為對照，用分光光度計在600 nm處測量OD值。

1.4.7 菌株對TC的降解能力

將菌接種到膽固醇培養(yǎng)基后最適溫度下培養(yǎng)48 h，每隔6個小時測定TC降解量，以不含TC為對照，將培養(yǎng)基在轉速為5 000 r/min下離心10 min，用膽固醇試劑盒測定TC的量。

1.4.8 菌株對TG的降解能力

將菌接種到甘油三酯培養(yǎng)基后最適溫度下培養(yǎng)48 h，每隔6個小時測定TG降解量，以不含TG為對照，將培養(yǎng)基5 000 r/min離心10 min，用甘油三酯試劑盒測定TG的量。

1.4.9 降脂機制的初步探究

將菌接種到膽鹽高脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后取5 mL，轉速為5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用無水乙醇反復洗滌3次后溶于pH值為7的磷酸鹽緩沖液，離心，測定上清液中TC和TG量A1。棄去此時上清液，加入無水乙醇超聲破碎，離心后搖勻，測定細胞破碎液中TC和TG量A2。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌基本特性的研究

2.1.1 菌株最適生長溫度和pH值的測定

為了確定乳桿菌最適生長條件，以pH值、溫度進行單因素實驗，如圖1和圖2所示。

圖1 最適pH值的測定

圖2 最適生長溫度的測定

由圖1和圖2可以看出，菌株在不同的pH值和溫度下生長狀況都不同。5種菌的最適pH值均為6.0，而LP的最適生長溫度為33℃，其余菌為37℃。實驗時采用最適條件培養(yǎng)乳桿菌。

2.1.2 菌株生長曲線及產酸能力的測定

在發(fā)酵產品中，乳桿菌利用葡萄糖或蔗糖產酸，使pH值下降。這不僅具有細菌學意義，而且能促進產品的干燥速度。為了了解菌株生長狀況及產酸性能，每隔2個小時測量OD600值，繪制5株菌的生長曲線和產酸曲線，如圖3和圖4所示。

圖3 生長曲線的測定

圖4 產酸能力的測定

由圖3和圖4可以看出，隨著時間的推移，菌株生長速率及產酸速率也不同，LC和LP生長速度較快，產酸能力也較強，20 h后，pH值已下降至3.81，之后OD值和pH值也變化很小，說明菌株生長已進入生長穩(wěn)定期。

2.1.3 菌株耐酸及耐膽鹽能力的測定

胃酸和膽汁鹽具有抗菌性，乳桿菌被食入后菌體必須通過胃液，同時還要能夠抵抗膽汁鹽。固菌種對胃酸及膽鹽的耐受性是衡量益生菌的重要指標[6]。對五株菌進行胃酸和膽鹽耐受性測試，結果如表1所示。

表1 乳桿菌耐酸耐膽鹽能力 %

由表1可以看出，5株菌均表現出了一定的益生功能，隨著膽鹽質量分數的增加，菌株存活率下降。在pH=3的人工胃液中，4種菌存活率均大于35%，其中，LGG和LA存活率分別為78.41%和66.02%；在膽鹽質量分數為0.3%時，LC和LP存活率均大于30%；LC，LP和LGG在pH=3且膽鹽質量分數為0.3%的MRS培養(yǎng)基中存活率分別為40.28%，44.11%，21.27%。

2.2 菌株降脂性能的測定

分別對5種菌進行體外膽固醇和甘油三酯降解實驗，并測定不同質量分數的膽鹽對菌株降解膽固醇的影響，結果如圖5～圖7所示。

由圖5和圖6可以看出，隨著時間的增加，菌株對膽固醇和甘油三酯的降解量逐漸增加。LB，LC，LGG降解膽固醇效果較好，分別為45.63%，48.13%，30.63%；LC降解甘油三酯效果較好，為23.06%。其中，LC對膽固醇和甘油三酯的降解能力顯著高于其他菌株，分別為45.60 mg/L和0.91 g/L。由圖7可知，當加入不同質量分數膽鹽后，由于膽鹽的抑菌作用，4種菌對膽固醇的降解作用都顯著下降，但LP對膽固醇的降解作用反而增強，降解率從23.12%增加至31.25%，可能由于LP將膽鹽分解后，膽固醇合成膽鹽，從而促進膽固醇的分解代謝，降低膽固醇質量濃度。

一般認為，能在pH=3的條件下存活2 h并能耐受0.1%膽鹽的乳桿菌就能順利通過胃和上段腸管到達下段腸管從而放大其生物學功效[7]。本研究將菌在pH=3的人工胃液孵育3 h，再在高脂培養(yǎng)基添加質量分數為0.3%膽鹽，培養(yǎng)后測定各菌株降脂能力，結果如表2所示。

表2 人工胃液孵育后的降脂能力

由表2可以看出，在模擬人體內環(huán)境后，菌株對膽固醇和甘油三酯的降解能力表現出了明顯的菌株特異性，其中，LC和LP的降脂性能較好，對膽固醇和甘油三脂的降解量分別為20.00，22.00 mg/L和0.86，0.12 g/L。

2.3 菌株降脂機制

關于益生菌降解膽固醇的機理，學者們提出了不同的假說，如膽鹽的脫結合，共沉淀，吸收等，甘油三酯的降解機制可能與膽固醇類似，但在國內外相關報告較少[8-9]。本研究通過對可能發(fā)生的共沉淀和吸收機制的研究，初步探究乳桿菌的降脂機理，結果如表3所示。

表3 菌株降脂能力及共沉淀的測定

研究表明，當pH值低于5.5時，膽固醇會隨著膽鹽一起沉淀下來，而此沉淀溶于pH值為7的磷酸鹽緩沖液。如表3所示，LB和LGG會使膽固醇和膽鹽發(fā)生共沉淀，前者還能吸附部分膽固醇至細胞內，從而吸收利用膽固醇。在緩沖液中并沒有發(fā)現甘油三酯，但在離心的菌體上清液中含有甘油三酯，說明LB和LC可能通過吸收或吸附的方式將甘油三酯利用。

3 結論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是我國食品領域中的一個非常重要的組成部分，它因具有獨特的色、香、味而深受人們的喜愛。功能性食品是新時代對傳統(tǒng)食品深層次的要求。本研究從西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬和乳品中分離篩選出5株乳桿菌，針對其益生方面進行研究，加強發(fā)酵產品功能性。實驗發(fā)現，5株菌都展現出較好的益生功能，對人工胃液均有一定的適應能力；通過降脂實驗表明，不同菌株在降脂能力方面都表現出了菌株特異性，其降解機理上也表現出了菌株特異性，膽固醇降解效果最好的是LC，降解率為48.1%，最低是LA，降解率僅為4.8%，甘油三酯降解效果最好的是LC，降解率為23.06%，其余4株菌均低于5%；當膽鹽質量分數增加，LP對膽固醇的降解作用反而增強，其余4株菌降解作用都下降，可能由于LP將膽鹽分解后，膽固醇合成膽鹽，從而增加了對膽固醇的利用率；目前國內外在乳桿菌利用甘油三酯方面的研究相對較少，本研究從甘油三酯降解機制上出發(fā)，發(fā)現乳桿菌在對甘油三酯的利用機制上可能與膽固醇利用機制類似，都是通過吸收或吸附方式，具體機制還有待進一步研究。

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