配對t檢驗法評價3種因素對乳酸菌總數檢測結果的影響

黃寶瑩，佘之蘊，劉海卿，林耀文，羅湘蓉，黃玲玲

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東順德528000）

0 引言

乳酸菌是一類能在可利用的碳水化合物發酵過程中產生大量乳酸的細菌，被廣泛地應用于發酵制品和生物制品領域。乳酸菌因具有健胃整腸[1]、抗腫瘤[2]、降低膽固醇、減少過敏反應[3]、抗氧化活性[4]等多種保健功能而備受消費者喜愛。按照《GB 4789.35-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》（GB法）[5]要求，乳酸菌數不得低于106mL-1。本文主要研究三種因素對GB法中的乳酸菌總數檢測方法的影響，評價不同培養基、含氧量和接種方法檢測結果的一致性、等價性或可交換性，以期為日常檢測和科研工作提供參考。

1 實驗

1.1 培養基

MRS瓊脂，TPY瓊脂，BBL瓊脂。

1.2 儀器與設備

CL-40M高壓滅菌鍋；GHP-9160隔水式恒溫培養箱；AC2-6S1生物安全柜；玻璃熱珠滅菌器；Easymix拍擊式均質器；dilumat S電子稀釋器；AnaeroPack厭氧培養罐。

2 方法

2.1 乳酸菌總數檢測

參照GB 4789.35-2010（GB法）對乳酸菌總數進行測定。對發酵乳樣進行10倍系列稀釋，選擇適宜的2-3個梯度，每個稀釋度吸取0.1 mL樣品勻液分別置于2個MRS瓊脂平板上進行涂布，并于（36±1）℃，厭氧培養48 h±2 h后計數平板上的所有菌落數。

2.2 不同培養基對乳酸菌總數檢測結果的影響

對同一個發酵乳樣品，分別用MRS、TPY和BBL培養基檢測乳酸菌總數，重復十次，操作步驟按2.1進行，運用SPSS軟件采用配對t檢驗對比分析，比較其均值是否存在差異[6-7]。

2.3 不同含氧量對乳酸菌總數檢測結果的影響

對同一個發酵乳樣品，按2.1測定乳酸菌總數，培養條件分別為厭氧（氧氣質量分數為0%）、微需氧（氧氣質量分數為8%～9%，二氧化碳質量分數為7%～8%）和需氧，重復10次，運用SPSS軟件采用配對t檢驗對比分析，比較其均值是否存在差異。

2.4 不同接種方法對乳酸菌總數檢測結果的影響

對同一個發酵乳樣品，按2.1測定乳酸菌總數，接種方法分別為傾注法和涂布法，涂布法取樣量為0.1 mL，傾注法取樣量為1 mL。運用SPSS軟件采用配對t檢驗對比分析，比較其均值是否存在差異。

3 結果與分析

3.1 不同培養基對乳酸菌總數檢測結果的影響

分別用MRS，BBL和TPY培養基檢測乳酸菌總數，結果如表1所示。表1除傾注法是計數10-6稀釋度結果，其他均為10-5稀釋度結果。為方便計算和分析，直接對計數結果進行配對t檢驗，各乳酸菌檢測結果均為2次平行實驗結果的平均值。表1中GB法即為MRS、厭氧和涂布的結果。MRS培養基的檢測結果分別與BBL和TPY是配對的兩組數據，運用SPSS軟件按照配對t檢驗進行分析，設臨界水平α=0.05，數據分析結果如表2和表3所示。

表1 各因素對乳酸菌總數檢測結果的影響

表2 培養基因素基本描述統計量

表3 培養基因素t檢驗結果

由表2可以看出，MRS，BBL和TPY培養基檢測結果的均值分別為202.70，222.20和181.40；標準差分別是19.49957，23.73371和22.90657。標準差MRS＜TPY＜BBL。說明MRS培養基的結果波動性相對小，精密度、再現性較好，有利結果的復現以及適用于實驗室之間比對。

表5 含氧量t檢驗結果

由表3可以看出，MRS與BBL均值之間的差值為-19.50，差值的標準差為29.38348，t值為-2.099，顯著性P為0.065＞0.05，說明MRS與BBL的檢測結果之間的差異不顯著。MRS與TPY均值之間的差值為21.30，差值的標準差為37.10960，t值為1.815，自由度為9，顯著性P為0.103＞0.05，說明MRS與TPY的檢測結果之間沒有顯著性差異。

3.2 不同含氧量對乳酸菌總數檢測結果的影響

分別在厭氧、微需氧和需氧條件下培養乳酸菌（如表1）。厭氧的檢測結果分別與微需氧、需氧是配對的兩組數據，運用SPSS軟件按照配對t檢驗進行分析，設臨界水平α=0.05，數據分析結果如表4和表5所示。

表4 含氧量基本描述統計量

由表4可以看出，厭氧、微需氧和需氧的檢測結果的均值分別為202.70、70.70和4.90；標準差分別是19.49957、19.81049和2.37814。從均值就可以直接看出含氧量對檢測結果影響非常大。檢測樣品中含有乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus.bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）四種菌株。各種乳酸菌或益生菌因普遍缺乏好氧的呼吸鏈（或電子傳遞鏈）酶系，以發酵方式獲取能量，故在與游離氧的關系上，大多數是一些耐氧性厭氧菌、微好氧菌、兼性厭氧菌或專性厭氧菌。多數耐氧性厭氧菌中存在SOD和過氧化氫酶，可使高毒性的O2-變成毒性稍低的H2O2，進一步還原成無毒的H2O。一些嚴格的厭氧菌既無SOD又缺乏過氧化氫酶或過氧化物酶，故細胞在有氧環境下形成的O2-極易殺死自己，這就是厭氧菌對氧的高度敏感性或氧對它們毒害的主要原因[8]。

由表5可以看出，厭氧與微需氧均值之間的差值為132.00，差值的標準差為28.11880，t值為14.845，顯著性P為0.000＜0.01，說明厭氧與微需氧的檢測結果之間的差異非常顯著。厭氧與需氧均值之間的差值為197.80，差值的標準差為19.24578，t值為32.501，顯著性P為0.000＜0.01，說明厭氧和需氧的檢測結果之間也是存在非常顯著的差異。

3.3 不同接種方法對乳酸菌總數檢測結果的影響

分別采用傾注法和涂布法進行接種，結果如表1所示。涂布法檢測結果與傾注法是配對的兩組數據，運用SPSS軟件按照配對t檢驗進行分析，設臨界水平α=0.05，數據分析結果如表6和表7所示。

表6 接種方法基本描述統計量

表7 接種方法t檢驗結果

表6結果顯示，涂布法和傾注法所得結果的均值分別為202.70和198.30；標準差分別是19.49957和16.09037。傾注法標準差小于涂布法。說明傾注法的結果波動性相對小。

由表7可以看出，涂布和傾注均值之間的差值為4.40，差值的標準差為21.10398，t值為0.659，顯著性P為0.526＞0.05，說明涂布和傾注的檢測結果之間的差異不顯著。傾注和涂布方法得到的乳酸菌總數基本一致，只是傾注法乳酸菌的菌落較小，較難觀察，而涂布法得到的菌落分布均勻，直徑較大，便于計數。

4 結束語

（1）研究結果發現，使用MRS，BBL，TPY培養基檢測乳酸菌總數所得結果在統計學上無顯著差異，檢測結果具有一致性。乳酸菌在MRS，BBL，TPY培養基上菌落形態也十分相似：乳黃色，直徑1～2 mm，圓形。這是由其營養、代謝等生理特性決定的。

（2）微需氧和需氧培養條件的乳酸菌總數檢測結果，與厭氧相比，都存在非常顯著的差異，說明含氧量對乳酸菌的生長繁殖產生很大的影響。不同品牌的酸奶本身含有的菌種類型不同，因而含氧量對不同樣品的乳酸菌總數影響很大。

（3）涂布法和傾注法所得檢測結果并無顯著性差異。兩種接種方法各有優缺點。涂布法的優點是菌落生長在表面，形態均勻，便于計數；缺點是取樣量小（0.1 mL）使得結果的標準差較大，平板不干燥或涂布不均勻反而影響計數，操作步驟也較為繁瑣。傾注法的優點是取樣量大（1 mL）使得結果波動性較小，操作簡單；缺點是乳酸菌在培養基內部生長時菌落較小，不利于觀察菌落形態和計數。綜上所述，在檢測過程中，兩種接種方法具有可交換性。

[1]王曦,許曉燕,余夢瑤,等.乳酸菌的保健功能及其作用機制研究進展[J].中國乳品工業,2010（9）：38-41.

[2]OHASHI Y,NAKAI S,TSUKAMOTO T,et al.Habitual Intake of Lactic Acid Bacteria and Risk Reduction of Bladder Cancer[J].Urol Int,2002,68（4）：273-280.

[3]NORY K,CHAMBERS S J,PN C,et al O ral delivery of Lacbbacillus casei Shirota modifies allergen-induced immune responses in allergic rhinitis[J].Clin Exp Allergy,2008,38（8）：1282-1289.

[4]VERENA J K,BRIGITTE MARIAN,REINHARD STIDL,et al.Impact of Lactic Acid Bacteria on Oxidative DNA Damage in Human Derived Colon Cells[J].Food and Chemical Toxicology,2008,46：1221-1229.

[5]中華人民共和國衛生部.GB 19302—2010食品安全國家標準發酵乳[S].北京：中國標準出版社,2010.

[6]張文彤.SPSS11統計分析教程（基礎篇）[M].北京：北京希望電子出版社,2002：223-229.

[7]劉慶武,張小清,羅玉玲,等.如何用SPSS、SAS進行t檢驗的運算[J].湘南學院學報,2004,04：49-51.

[8]熊德鑫,劉秉陽.氧氣對厭氧菌的毒性作用機理[J].國外醫學：微生物學分冊,1983,01：6-8.