克羅諾桿菌分子鑒定方法的比較

遲濤，方景泉，滿朝新，許慧

（1.國家乳業工程技術研究中心，黑龍江省乳品工業技術開發中心東北農業大學，哈爾濱150028；2.國家大豆工程技術研究中心黑龍江省大豆技術開發研究中心東北農業大學，哈爾濱150028）

0 引言

克羅諾桿菌（原名阪崎腸桿菌）屬于腸桿科，是一種周生鞭毛、能運動、兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞機會性致病菌，能夠感染嬰兒和成人[1,2]。更重要的是，克羅諾桿菌屬于嬰兒配方乳粉（PIF）中的A類致病菌，新生兒尤其是體重較輕的早產兒攝入被克羅諾桿菌污染的PIF后，會導致嚴重的壞死性小腸結腸炎、菌血癥和腦膜炎等疾病，死亡率高達40%～80%[3-5]。克羅諾桿菌的鑒定方法有很多，如顯色培養基和API2.0E系統，然而這些根據克羅諾桿菌理化性質建立的鑒定方法不能從分子生物學角度對克羅諾桿菌進行鑒定[6]。本研究利用16S rRNA及看家基因fusA從分子生物學角度對克羅諾桿菌進行鑒定，并比較這兩種方法的優缺點，從而為克羅諾桿菌的鑒定提供理論支持。

1 實驗

1.1 材料

試驗菌株：本實驗保存的分離自嬰兒配方乳粉的11株克羅諾桿菌，并選擇陰溝腸桿菌ATCC 35030、產期腸桿菌ATCC 3048、大腸桿菌O157和大腸桿菌CMCCB 44113作為參考株。

主要試劑：營養肉湯（NB），胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），瓊脂糖，分子試劑，細菌全基因組DNA提取試劑盒，2×Taq PCR Master Mix（含染料），雙蒸水。

主要儀器：QT-1型旋渦混合器，水浴鍋，PL203型電子分析天平，潔凈工作臺VD-1320，DYY-10C型電泳儀，UVP凝膠呈相系統。

1.2 方法

1.2.1 克羅諾桿菌的活化與純化

取出-20℃甘油保存的含有克羅諾桿菌的凍存管，將菌株恢復至室溫后，按2%的接種量接種于NB液體培養基，37℃培養8～12 h進行活化。若菌株為單一菌體，活化后即可進行后續試驗，若活化菌株不純需進行純化后才能進行后續試驗，即將活化后的菌株在TSA固體培養基上進行三區劃線，37℃培養24 h后挑取單菌落，置于10 mL液體NB培養基中進行純培養，連續傳代2次后即可進行后續試驗。

1.2.2 克羅諾桿菌DNA的提取

取2 mL克羅諾桿菌的NB培養液，按照天根細菌全基因組DNA試劑盒的說明書進行克羅諾桿菌DNA的提取，并將提取的DNA置與-20℃冰箱中保藏備用。

1.2.3 克羅諾桿菌16S rRNA的PCR擴增

以克羅諾桿菌總DNA為模板，利用細菌16SrDNA通用引物進行PCR擴增，引物序列如表2-1。PCR的反應體積為50 μL，反應體系為：模板2 L，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix（含染料）25 uL，雙蒸水21 uL。反應條件：94℃預變性5 min，94 ℃ 變性30 S，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環30次，最后72℃延伸7 min。樣品置于4℃冰箱內保存，PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，UVP凝膠成像系統拍照記錄結果。

表1 引物序列

1.2.4 克羅諾桿菌fusA基因的PCR擴增

以克羅諾桿菌總DNA為模板，利用fusA特異性引物進行PCR擴增，引物序列如表1所示。PCR的反應體積為50 μL，反應體系為：模板2 uL，上下游引物各1 uL，2×Taq PCR Master Mix（含染料）25 μL，雙蒸水21 μL。反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環30次，最后72℃延伸5 min[6]。樣品置于4℃冰箱內保存，PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，UVP凝膠成像系統拍照記錄結果。

1.2.5 克羅諾桿菌生物信息學分析

將PCR產物送往，進行基因測序，得到克羅諾桿菌的序列。將16 S rRNA的序列在NCBI中進行比對，進行克羅諾桿菌的鑒定；將fusA的序列在克羅諾桿菌數據庫中進行比對（http：//pubmlst.org/cronobacter/）得到fusA基因的等位基因號。并利用MEGA6軟件對克羅諾桿菌的16S rRNA和fusA基因進行系統發育分析，選用最大似然算法，重復1 000次[7]。

2 結果與討論

2.1 克羅諾桿菌16S rRNA的分析

將克羅諾桿菌16S rRNA的測序結果在NCBI上進行比對，11株克羅諾桿菌的比對結果如表2所示；利用MEGA6軟件對11株和4株參考株進行系統發育分析，其系統發育樹如圖1所示。

由表2可以看出，11株菌株中9株被鑒定為阪崎克羅諾桿菌，而編號為7和11的菌株經過blast比對，為阪崎克羅諾桿菌和丙二酸陽性克羅尼桿菌的可能都為99%。通過11株克羅諾桿菌的系統發育樹可知，利用16S rRNA的通用引物對克羅諾桿菌進行分析，可以很好的與其他血緣相近的微生物區分，但是在克羅諾桿菌內的辨識度不強，呈現相近的系統發育關系。

表2 11株克羅諾桿菌NCBI比對結果

圖1 11株克羅諾桿菌16S rRNA最大似然系統發育樹

2.2 克羅諾桿菌fusA基因的分析

將克羅諾桿菌fusA的測序結果在克羅諾桿菌數據庫中進行比對，11株克羅諾桿菌fusA的等位基因號分別為1，7，8，11，12，13，14，15，16，17和37；其中根據比對9株為阪崎克羅諾桿菌，2株為丙二酸陽性克羅諾桿菌。利用MEGA6軟件對11株和4參考株的fusA基因進行系統發育分析，其系統發育樹如圖2所示。圖2呈現出了清晰的系統發育關系，其中等位基因fusA為7和13的丙二酸陽性克羅諾桿菌在系統發育關系中遠離了阪崎克羅諾桿菌，這說明利用fusA基因可以將克羅諾桿菌進行種種之間的鑒定。

圖2 11株克羅諾桿菌fusA基因最大似然系統發育樹

2.3 兩種鑒定方法的比較

16S rRNA是傳統的微生物鑒定的分子方法，與基于理化檢驗的鑒定方法相比，它具有其自身的優越性。16S rRNA的分子鑒定方法是基因微生物16S rRNA序列排列的，可以從分子層面對微生物進行定性分析。然而，由于16S rRNA的特異性不強且多樣性并不豐富，很難將待鑒定的微生物精確到種的水平，且容易產生誤差[9]。由于克羅諾桿菌不同種之間最少的共享性，fusA基因可以用來克羅諾桿菌的鑒定，并且利用fusA基因對325株克羅諾桿菌進行了鑒定，并且區分到了種的水平[8]。此外xXiaoke Xu等人也利用fusA基因對克羅諾桿菌進行了鑒定，基于fusA的鑒定方法越來越被人們認可[10]。本研究選取了具有代表意義的克羅諾桿菌進行了鑒定，其中利用16S rRNA的鑒定方法不能將11株克羅諾桿菌精確到種，而基于fusA的鑒定方法能將克羅諾桿菌精確到種，這也證明了看家基因fusA在克羅諾桿菌的分子鑒定中具有優越性。

3 結論

克羅諾桿菌具有感染嬰兒和成人的能力，能夠通過污染嬰兒配方乳粉感染新生兒，尤其是體重較輕的早產兒，一旦被感染會引起嚴重的壞死性小腸結腸炎、膿血癥、腦膜炎等疾病，嚴重威脅嬰幼兒的健康。

本實驗選取11株分離自嬰兒配方乳粉中的克羅諾桿菌為研究對象，利用16S rRNA和看家基因fusA對克羅諾桿菌進行分子層面的鑒定，并得到了兩者清晰的系統發育關系，結果表明兩種分子鑒定的方法都能對克羅諾桿菌進行鑒定，且基于看家基因fusA的鑒定方法具有更高的辨識度，能將克羅諾桿菌的鑒定精確到種。因此利用看家基因fusA對克羅諾桿菌進行分子鑒定具有優越性，本研究的實驗結果有助于克羅諾桿菌的分子鑒定，為克羅諾桿菌的進一步研究提供了理論基礎。

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