UHRF1蛋白在結直腸癌中的表達情況及其預后判斷價值

吳李飛，郝佳潔，張彤彤，梁建偉，王 征，張 鈺，徐 昕，蔡 巖，王明榮，*，李 敏，*

（1. 安 徽醫科大學附屬安慶醫院，安慶市立醫院消化內科，安徽 安慶 246003；2. 中 國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院腫瘤研究所，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021；3. 中 國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院腫瘤研究所腹部外科，北京 100021）

UHRF1蛋白在結直腸癌中的表達情況及其預后判斷價值

吳李飛1，郝佳潔2，張彤彤2，梁建偉3，王 征3，張 鈺2，徐 昕2，蔡 巖2，王明榮2，*，李 敏1，*

（1. 安 徽醫科大學附屬安慶醫院，安慶市立醫院消化內科，安徽 安慶 246003；2. 中 國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院腫瘤研究所，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021；3. 中 國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院腫瘤研究所腹部外科，北京 100021）

結直腸癌是世界第3大惡性腫瘤，其全球每年新發病例超過130萬，死亡人數約70萬，而在我國其發病率和死亡率均已分別達第4和第5位，且近年來發病人數呈明顯上升趨勢［1］，對人民的生命健康構成重大威脅。目前，結直腸癌的主要治療手段是外科手術切除，術后輔助放化療等以提高根治率，但由于局部復發和淋巴結轉移等因素的影響，結直腸癌患者術后生存時間及生活質量仍不容樂觀。為此，檢測結直腸腫瘤中的分子改變，挖掘與腫瘤患者預后相關的生物學標志物，探索對某種治療方法敏感個體的共同特征將可能有助于對不同生物學特征的結直腸癌患者實施個體化治療，改善預后。

UHRF1（ubiquitin-like PHD and ring finger domains 1），即泛素樣含PHD和環指域1，是近年新發現的一種與細胞生長有關的核蛋白基因，其編碼的蛋白又稱ICBP90/NP95，由類泛素（ubiquitin-like，UBL）模體、PHD（plant homeodomain）結構域、鋅指模體（zinc finger motif）和SET-環指狀結構域（SET-and ring-associated domain，SRA）4部分組成［2］。UHRF1的表達與細胞的分化程度和增殖能力相關，即分化程度越低、增殖能力越強，UHRF1的表達水平也越高，例如外周血白細胞和中樞神經細胞等高分化非腫瘤細胞中未見UHRF1表達，而在胎兒和成人胸腺、胎肝、睪丸和骨髓等增殖細胞中UHRF1的表達水平較高［3］。近來文獻報道，該蛋白在肺癌［4-5］、乳腺癌［6］、膀胱癌［7］、前列腺癌［8］、胃癌［9］、甲狀腺癌［10］和喉鱗癌［11］等多種腫瘤組織中上調，其高表達與肺癌［5］、膀胱癌［7］、喉鱗癌［11］患者的術后生存時間負相關，且均為獨立預后因子。

Kofunato等［12］在結直腸癌中也發現UHRF1過表達現象，但未就其對結直腸癌患者的預后判斷價值進行評估。本研究采用組織微陣列聯合免疫組織化學技術（tissue microarrays and immunohistochemistry，TMAIHC）檢測結直腸癌患者癌組織及其相應癌旁組織中UHRF1蛋白的表達水平，并分析其與結直腸癌患者臨床病理指標的相關性，探討UHRF1蛋白是否可作為結直腸癌預后判斷的分子標志物，為結直腸癌患者治療方式的進一步優化提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集

收集201例結直腸癌手術切除的腫瘤組織及其配對手術切端形態學正常的上皮組織。全部病例于2006-2010年期間在中國醫學科學院腫瘤醫院收取，均經病理學診斷證實為結/直腸腺癌，其中男性119例，女性82例；年齡14～91歲，中位年齡59歲；腫瘤T2、T3、T4期分別為16、118和67例；有和無淋巴結轉移分別為110和91例；腫瘤高、中、低分化分別為8、163和30例。其中有完整隨訪病例167例，中位生存時間為46.7個月（2.8～103.6個月）。所有患者術前均未接受放、化療等任何抗腫瘤治療。標本取材后均進行常規福爾馬林固定和石蠟包埋。

1.2 組織芯片制備

對組織標本石蠟塊進行切片、HE染色，顯微鏡下閱片，選取相應的組織蠟塊并采點標記。每個病例標記3個典型的癌組織點和2個正常組織點，利用穿刺針管將標記好的供體臘塊中的組織移入受體臘塊，制作成組織微陣列。每張組織微陣列切片厚度為4 μm。

1.3 免疫組化染色

石蠟組織芯片經常規二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶15 min，0.1%枸櫞酸鈉緩沖液中微波加熱修復20 min；滴加一抗（鼠抗人UHRF1單抗，BD公司），并將片子置于濕盒內4 ℃ 過夜；PBS浸洗后滴加二步法免疫組化檢測試劑盒PV9000 （中杉金橋生物技術公司）中的試劑Ⅰ（增強劑）和試劑Ⅱ（ HRP標記聚合物），在37 ℃孵箱中分別孵育20和30 min；DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性膠封片后鏡檢。

1.4 免疫組化評分

陽性信號定位于細胞核，不同病例蛋白表達差異主要在于陽性信號強度的不同。根據表達強度將評分分為4級：0分（不著色），1分（淺棕色），2分（棕黃色），3分（深棕色）。每例腫瘤及配對的手術切端形態學正常的組織點均分別進行評分，取各自最高分為最終評分。

1.5 統計學分析

使用統計學分析軟件SPSS 21.0進行數據分析。利用配對樣本t檢驗分析UHRF1蛋白在腫瘤組織和手術切端形態學正常的上皮組織中的表達差異，采用雙側χ2檢驗方法分析蛋白表達改變與臨床病理指標的相關性。采用Kaplan-Meier方法分析UHRF1蛋白表達與患者術后總生存時間之間的關系，進一步通過Cox比例風險模型分析不同臨床病理指標和UHRF1蛋白表達水平對患者術后生存時間的影響。以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 UHRF1蛋白在結直腸癌組織中的表達情況

免疫組化結果顯示，UHRF1蛋白陽性表達主要定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色，在不同患者腫瘤組織中的表達水平差異較大（圖1）。UHRF1蛋白在結直腸癌組織中表達陽性率為54.2%（109/201），其中強表達、中度表達和弱表達的頻率分別為15.4%（31/201）、12.4%（25/ 201）和26.4%（53/201）；而在配對的手術切端形態學正常的上皮組織中陽性率僅為9.93%。UHRF1蛋白表達在腫瘤與正常組織之間具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 UHRF1蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理指標之間的關系

我們進一步分析了UHRF1蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理指標之間的關系，結果顯示UHRF1蛋白表達除了在近端結腸（回盲部、升結腸、結腸肝曲、橫結腸及結腸脾曲）、遠端結腸（降結腸、乙狀結腸）和直腸等不同部位的腫瘤組織中存在顯著性差異（P=0.008），遠端結直腸癌中的陽性率顯著高于近端結腸癌外，而UHRF1蛋白表達與其他臨床病理指標均無顯著相關性（表1）。

2.3 UHRF1蛋白陽性表達與患者術后生存時間的關系及其獨立預后判斷價值

Kaplan-Meier分析結果顯示，UHRF1蛋白的表達與結直腸癌患者術后生存時間顯著相關，該蛋白表達陽性患者的術后生存時間顯著短于表達陰性患者的術后生存時間（P=0.023）（圖2）。Cox回歸分析表明，UHRF1蛋白表達（P=0.008）、分化程度（P=0.011）和淋巴結轉移（P=0.005）為結直腸癌患者術后的獨立預后因素（表2）。

3 討 論

多項研究顯示UHRF1在人類多種惡性腫瘤中表達上調［4-11］，參與細胞增殖［12-14］、凋亡［15-16］、細胞周期調控［17］等重要的生物學過程，并與腫瘤放化療敏感性相關［15，18-19］。Jenkins等［14］發現UHRF1的鋅指結構對維持泛素連接酶的活性至關重要，敲降UHRF1對人肺癌細胞和宮頸癌細胞的生長有明顯抑制作用，Daskalos等［4］有類似報道；而Hopfner等［20］研究顯示在人肺成纖維細胞中過表達UHRF1后接觸抑制現象被削弱。Li等［15］將UHRF1正義轉染乳腺癌細胞，發現UHRF1過表達可同時降低腫瘤細胞自發凋亡和輻射所引起的細胞凋亡，Abbady等［16］的研究結果也支持這一現象。Jeanblanc等［17］研究認為UHRF1通過與甲基化RB1基因啟動子結合，促使細胞從G1期進入S期，參與細胞周期調控。UHRF家族所特有的SRA結構域與半甲基化的GG位點有很高的親和性，使DNA在復制過程中維持甲基化狀態，導致RASSF1［4］、CDKN2A［4，13］和BRCA1［6］等抑癌基因永久沉默。此外，Li［15］、Un［18］和Muto［19］的研究表明，UHRF1的高表達在腫瘤放化療敏感性中具有重要作用，有可能作為腫瘤放化療增敏的新靶點。

在我們的研究中，UHRF1在結直腸癌及其配對正常組織中的陽性表達率分別為54.2%和9.93%，前者顯著高于后者（P＜0.01）。Kofunato等［12］的研究表明結直腸癌中UHRF1表達率為65.8%（152/231），而在正常結直腸上皮中則未見UHRF1的表達。由于結直腸手術切端正常組織在包埋和切片過程中可能出現橫縱切面的差別，導致一些切片中基底層上皮細胞很少。因此我們推測，上述結直腸正常腺上皮中的表達差異可能是由于縱橫切面差異造成的，當然也不排除這種差異可能與二者陽性標準及樣本取材位置有關。值得關注的是，我們還發現UHRF1的陽性表達與腫瘤位置有關，總體看來遠端結直腸癌的陽性率顯著高于近端結腸癌組織。另一方面，與之前在肺癌［5］、膀胱癌［7］、喉鱗癌［11］等研究相一致，UHRF1的表達與結直腸癌的預后呈負相關關系（P=0.023），而且是一種結直腸癌根治術患者的獨立預后因子（P=0.008）。

綜上所述，UHRF1的陽性表達與結直腸癌患者預后較差顯著相關。檢測UHRF1蛋白的表達水平變化可能有助于對結直腸癌患者進行預后評估，然而其在結直腸癌發生進展過程中的作用機制仍需要進一步研究。

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Expression and prognostic
value of UHRF1in colorectal cancer

WU Lifei1， HAO Jiajie2，ZHANG Tongtong2，LIANG Jianwei3，WANG Zheng3，ZHANG Yu2，XU Xin2，CAI Yan2，WANG Mingrong2，*，LI Min1，*
（1. Department of Gastroenterology， Anqing City Hospital， Affiliated Anqing Hospital of Anhui Medical University， Anqing 246003，Anhui； 2. State Key Laboratory of Molecular Oncology，Cancer Institute/Hospital， Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021；3. Department of Abdominal Surgery， Cancer Institute/Hospital，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021， China）

目的：探討泛素樣含PHD和環指域1（UHRF1）蛋白在結直腸癌中的表達及其預后判斷價值。方法：采用組織微陣列聯合免疫組織化學（TMA-IHC）技術檢測201例結直腸癌中UHRF1蛋白的表達情況，分析其與臨床病理指標及術后生存時間之間的相關性。結果：UHRF1蛋白在結直腸癌組織中的表達陽性率為54.2%（109/201），顯著高于配對的手術切端形態學正常的組織（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存分析顯示，UHRF1蛋白表達陽性患者術后生存時間短于表達陰性的患者（P=0.023）。Cox回歸分析結果表明，UHRF1蛋白是結直腸癌患者根治術后的一個獨立預后因素（P=0.008）。結論：UHRF1蛋白可能作為結直腸癌患者術后預后判斷的分子標志。

UHRF1；結直腸癌；分子標志；預后判斷

OBJECTIVE:This study aimed to evaluate the expression and prognostic significance of ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1 （UHRF1） protein in colorectal cancer （CRC）.METHODS：The expression of UHRF1 in 201 CRC cases and adjacent normal tissues were detected by tissue microarrays and immunohistochemistry（TMA-IHC），then the relationship between UHRF1 protein expression and clinio-pathological parameters as well as its prognostic value were examined by statistical analysis.RESULTS：Positive expression of UHRF1 was observed in 54.2%（109/201） of CRC tissues，and the frequency in CRC was significantly higher than that in adjacent nomal tissues （P＜0.01）. Kaplan-Meier survival curves showed that CRC patients with negative expression of UHRF1 had shorter overall survival time （P=0.023）. Cox regression analysis indicated that UHRF1 protein expression was an independent prognostic factor（P=0.008）.CONCLUSION：UHRF1 might be a biomarker f or prognostic evaluation of CRC patients.

UHRF1；colorectal cancer；molecular marker；prognostic evaluation

R735.3

A

1004-616X（2015）01-0030-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.007

2014-11-17；

2014-12-30

公益性行業科研專項（201402003）

作者信息：吳李飛，E-mail：wulifei0556@yeah.net。*通信作者，王明榮，E-mail：wangmr2015@126.com；李 敏，E-mail：lmin0556@163.com