去甲斑蝥素對人肺腺癌A549細胞的抑制作用

崔寶弟，王敏，孫震曉*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京100102）

去甲斑蝥素對人肺腺癌A549細胞的抑制作用

崔寶弟，王敏#，孫震曉*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京100102）

肺癌是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤，其總體發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，已成為各種腫瘤死亡的首要原因，嚴重威脅人類健康。肺癌也已成為我國近十幾年來發(fā)病率和死亡率增長速度最快的腫瘤［1］。

2010版藥典記載斑蝥有破血逐瘀，散結(jié)消癥，攻毒蝕瘡的功能［2］。斑蝥在我國己有兩千余年的用藥歷史，現(xiàn)代研究表明它具有明顯的抗腫瘤作用［3］。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是斑蝥中抗腫瘤活性成分斑蝥素的去甲基衍生物，與斑蝥素相比，毒性更小，臨床上用于肝癌的治療，對肺癌、乳腺癌和白血病細胞也有較強的抑制作用［4-5］。去甲斑蝥素具有一定升高外周血白細胞的作用，與多數(shù)抗癌藥物具骨髓抑制的不良反應(yīng)相比，具有一定的優(yōu)勢［6］。因此，本文研究去甲斑蝥素對人肺腺癌A549細胞的細胞毒作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人肺腺癌A549細胞購于北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞庫。

1.1.2 試劑與藥品 RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；NCTD購自Sigma公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、四甲基噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium b romide，MTT）、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na）等購自Ameresco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、 無水乙醇、95%乙醇、濃鹽酸、甘油、NaOH等均購自北京化學(xué)試劑公司，均為市售分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞用含l0% （V/V）胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS），100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃，體積分數(shù)為5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。

1.2.2 細胞計數(shù) 采用細胞血球計數(shù)板法：取稀釋混勻的細胞懸液10 μL，輕輕打入放置蓋片的血球計數(shù)板中，倒置顯微鏡下計數(shù)，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 MTT法檢測NCTD對A549細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的細胞，以每孔1 000個的密度接種于96孔板，培養(yǎng) 24 h后換含 15、30、40、60、80和120 μmol/L NCTD的培養(yǎng)基。24、48和72 h后加入終濃度為0.5mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩5～10min，酶標(biāo)儀在550 nm處測得吸光度值。每次試驗取3個平行孔，重復(fù)3次。以NCTD濃度為橫坐標(biāo)，以存活率為縱坐標(biāo)繪制存活曲線，并按下式計算存活率。

1.2.4 細胞恢復(fù)試驗 取對數(shù)生長期細胞，以每孔2 000個的密度接種于96孔板，24 h后換含 30、60、120、240和480 μmol/L NCTD的培養(yǎng)基，并測加藥0h的吸光度值D（550）。加藥作用24 h后，換未加藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并測恢復(fù)0 h的吸光度值D（550）。后每隔24 h測定吸光度值，連續(xù)測定5 d。以天數(shù)為橫坐標(biāo)，以存活率為縱坐標(biāo)繪制存活率曲線。

1.2.5 細胞形態(tài)學(xué)觀察 以每孔1.2×105個的密度取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，24 h后加入含40、50、60 μmol/L NCTD的培養(yǎng)基處理0～72 h，在0、24、48、72 h時用倒置相差顯微鏡觀察NCTD作用狀態(tài)下的細胞形態(tài)。

1.2.6 流式細胞術(shù)測定細胞周期與凋亡 以每皿2×106個的密度將對數(shù)生長期的細胞接種于直徑10cm的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，接種30 h后換含40、50、60μmol/L NCTD的培養(yǎng)基，并收集0 h細胞，后每隔24 h收集24、48和72 h細胞，4 ℃保存過夜。1 000 r/min 離心5 min棄上清。500 μL PBS重懸，加入RNaseA至終濃度20 μg/mL， 37 ℃水浴45 min。再加入PI染液至終濃度50μg/mL，4 ℃避光染60 min。最后流式細胞儀檢測1×104個細胞，上機前常規(guī)進行光路流路校準。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 NCTD對A549細胞活力的影響

NCTD對肺癌細胞A549生長活力的影響如圖1，與對照組相比，在30～240 μmol/L范圍內(nèi) （ 除30μmol/L的24 h組外），NCTD使A549 細胞活力均明顯下降（P均＜ 0.05或P＜0.01），并且隨著劑量和時間增加，細胞活力逐漸下降。

2.2 恢復(fù)培養(yǎng)5 d細胞的存活率

如圖2，在30～240 μmol/L濃度范圍內(nèi)，NCTD對A549細胞的生長抑制作用在藥物撤除24 h后逐漸消失，并且在NCTD各個濃度作用下，細胞在隨后的幾天里有不同程度的恢復(fù)。 30～60 μmol/L NCTD作用24h后，A549細胞的活力在恢復(fù)培養(yǎng)的第5天完全恢復(fù)，與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 NCTD作用后A549細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

40、50 和60 μmol/L NCTD作用A549細胞0～72 h，細胞形態(tài)變化結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，A549細胞的生長受到抑制，隨著作用濃度的增加和作用時間的延長，A549細胞變圓浮起增多。

2.4 細胞周期分析

NCTD作用A549細胞0 h的細胞周期分布為：G0～G1期69.9%、S期21.4%、G2～M期9.4%，凋亡率為0.12%。NCTD作用A549細胞24～72 h的細胞周期如表1～ 3及圖4所示。不同濃度NCTD作用0～72 h，對A549細胞表現(xiàn)為明顯的G2～M期阻滯，與對照組相比，各濃度NCTD處理組未見明顯細胞凋亡發(fā)生。

3 討 論

去甲斑蝥素為斑蝥素的結(jié)構(gòu)同類物，臨床上具有較強抗腫瘤活性并有升高外周血白細胞的作用。臨床用于肝癌、食管癌、胃及賁門癌等以及白細胞低下癥，亦可作為術(shù)前用藥或用于聯(lián)合化療，與其他化療藥物聯(lián)用能提高療效、減少副作用。近年來主要用于消化道腫瘤和肺癌的治療。但是NCTD對肺癌的抑制作用及抗癌機制尚不明確。

本研究表明，NCTD在一定濃度下對肺癌細胞A549的生長有明顯抑制作用，并且這種生長抑制作用在NCTD撤除后逐漸消失。NCTD在抑制細胞生長的過程中伴隨著細胞變圓浮起，通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，NCTD主要通過G2～M期阻滯影響A549細胞的生長。

有研究表明，NCTD可以通過損傷腫瘤細胞DNA，影響細胞周期調(diào)控蛋白，從而阻止腫瘤細胞周期，抑制其增殖，例如降低胰腺癌細胞內(nèi)CDK1的表達，使其停滯于G2～M期［7］；下調(diào)宮頸癌細胞中Cyclins B和Cdc2的表達，使其停滯于G2/M期［8］，抑制細胞生長。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，NCTD主要通過誘導(dǎo)人卵巢癌SK-OV-3細胞G2/M期阻滯和細胞凋亡抑制細胞生長。干擾細胞有絲分裂過程中微管的組裝和紡錘體的形成可能是NCTD誘導(dǎo)SK-OV-3細胞M期阻滯的原因之一，而NCTD誘導(dǎo)的SK-OV-3細胞發(fā)生凋亡可不依賴細胞M期阻滯［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)，NCTD可以通過破壞膽管癌RBE細胞Tubulin骨架、抑制α-Tubulin mRNA的表達，阻止紡錘體的形成，將細胞周期阻滯在G2～M期，導(dǎo)致生長抑制［10］，我們前期的研究也表明，NCTD 可以在體外抑制微管蛋白的聚合，并在SK-OV-3細胞中得到驗證［11］。近年來，科學(xué)家新提出一種細胞死亡概念，稱為有絲分裂災(zāi)變死亡（mitotic catastrophe， MC），用來描述由于細胞有絲分裂異常或細胞長時間阻滯在有絲分裂期而誘發(fā)的一種細胞死亡方式，可以在離子輻射、化療藥物或高溫作用下發(fā)生［12］。NCTD誘導(dǎo)A549細胞G2～M期阻滯是否會導(dǎo)致細胞有絲分裂災(zāi)變死亡，尚需要進一步研究。

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The inhibition of norcantharidin on human lung adenocarcinoma A549 cells

CUI Baodi，WANG Min#，SUN Zhenxiao*
（Department of Biopharmaceutical， School of Chinese Pharmacology，Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

目的： 研究去甲斑蝥素（NCTD）對人肺腺癌A549細胞的細胞毒作用，并初步探討其作用機制。方法：采用四甲基噻唑藍（MTT）試驗檢測0～240 μmol/L NCTD在0～72 h內(nèi)對A549細胞活力的影響；NCTD處理A549細胞24 h后換正常培養(yǎng)基，用MTT方法檢測細胞恢復(fù)與增殖的情況；采用倒置顯微鏡觀察A549細胞經(jīng)40、50和60 μmol/L NCTD處理0～72 h后細胞形態(tài)學(xué)的改變；通過流式細胞術(shù)檢測40～60 μmol/L NCTD對細胞周期和凋亡的影響。結(jié)果：30～240 μmol/L NCTD對A549細胞有明顯的生長抑制作用（P＜0.05）；在30～120 μmol/L濃度范圍內(nèi)，NCTD對A549細胞的生長抑制作用在NCTD撤除24 h后逐漸消失，30～60 μmol/L NCTD作用A549細胞24 h后，A549細胞的活力在恢復(fù)培養(yǎng)的第5天完全恢復(fù)；40、50和60 μmol/L NCTD作用A549細胞0～72 h，細胞表現(xiàn)為明顯的G2～M期阻滯，與對照組相比，NCTD誘導(dǎo)A549細胞凋亡作用不明顯（P＞0.05）。結(jié)論：40～60 μmol/L NCTD主要通過誘導(dǎo)A549細胞G2～M期阻滯而抑制細胞生長。

去甲斑蝥素；肺癌；A549細胞；細胞周期；細胞凋亡

OBJECTIVE:To study the effects of norcantharidin （NCTD） on human lung cancer cells，and investigate the mechanisms.METHODS：The growth inhibition of A549 cells treated with 0-240μmol/L NCTD for 0-72hours was analyzed by MTT assay. The recovery growth and proliferation of A549 cells treated with 0-120 μmol/L NCTD for 24 h was evaluated by MTT assay. The morphological changes of A549 cells treated with 40，50 and 60 μmol/L NCTD for 0-72 h were examined under inverted microscope. The apoptosis and cell cycle changes of A549 cells treated with 40-60μmol/L NCTD were detected by flow cytometry.RESULTS：NCTD inhibited the growth of A549 cells in 30-240μmol/L（P＜0.05）. Cell growth inhibition could hardly be detected 24 h after 30-240 μmol/L NCTD was removed from culture medium. The vitality of A549 cells was fully recovered in 5 d after 30-60 μmol/L NCTD was removed from culture medium. A549 cells showed G2-M phase block but no obvious apoptosis compared with the control group when treated with 40，50 and 60 μmol/L NCTD for 0-72 h.CONCLUSION：NCTD （40-60 μmol/L） inhibited human lung cancer A549 cell growth mainly by cell G2-M phase block.

norcantharidin；lung cancer；A549 cell；cell cycle ； apoptosis

R734.2

A

1004-616X（2014）01-0021-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2014.01.005

2014-06-22；

2014-09-23

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題項目（2014JYBZZ-XS097）；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題項目（2013JYBzz-XS088）作者信息： 崔寶弟，E-mail：cbdbaodi@sina.com。#該作者對本文的貢獻與

等同。*通信作者，孫震曉，Tel：010-84738646； Email：sunzxcn@hotmail.com