大豆苷元對乳腺癌生長和血管生成的影響

康欣梅，王 慧，王 麗，湯大北，張清媛

（哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院內科，黑龍江哈爾濱 150081）

大豆苷元對乳腺癌生長和血管生成的影響

康欣梅，王 慧，王 麗，湯大北，張清媛

（哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院內科，黑龍江哈爾濱 150081）

大豆異黃酮（soybean isoflavone）存在于堅果、蠶豆、大豆及豆制品中，具有廣泛的營養學價值。其化學結構已經非常明確，基本骨架為3-苯基苯并二氫呋喃，包括染料木黃酮（又名染料木素）（genistein）、黃豆素（glycetein）和大豆苷元（daidzein）3種苷元［1］，染料木黃酮和大豆苷元是大豆異黃酮中活性最為顯著的兩類［2］。

大豆異黃酮與哺乳動物雌激素有相似的分子結構［3］，能與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合，發揮雌激素樣作用［4］，如治療絕經后女性更年期綜合征、抗骨質疏松、抗氧化、心血管保護、抗腫瘤等［4-6］。大豆苷元是大豆異黃酮中的一類，目前的研究發現大豆異黃酮具有誘導癌細胞凋亡［7］、抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲等作用［8］，但對于大豆苷元與腫瘤血管生成關系方面的研究鮮見報道。本研究擬通過建立乳腺癌大鼠模型，檢測大豆苷元與乳腺癌大鼠血管調節因子和微血管密度（microvessel density，MVD）的關系，進而探討大豆苷元對乳腺癌血管生成和腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD大鼠，雌性，6周齡，體質量（180±5）g，購自黑龍江省腫瘤防治研究所動物實驗中心。生產許可證號：SCXK（黑）2006-2008。使用許可證號：SYXK（黑）2006-030。大豆苷元購自西安飛達生物技術有限公司；7，12-二甲基苯蒽（7，12-dimethylbenz［α］ anthraxcene， DMBA）購自美國Sigma公司；單克隆CD34抗體為美國Santa Cruz公司產品；TUNEL試劑盒購自上海羅氏公司；抗-BrdU抗體（美國Sigma公司）購自上海貿易有限公司；大鼠血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和內皮抑素（endostatin）ELISA試劑盒均為美國R&D公司產品。

1.2 乳腺癌大鼠模型的建立及分組

取60只大鼠，每只給予含20 mg DMBA的玉米油1mL灌胃（根據預實驗確定造模的DMBA劑量）。約6～8周后可觸及腫瘤，當腫瘤生長至300～450 mm3時，將大鼠隨機分為5組，每組12只，每日分別給予0（對照組）、10、25、50和75 mg/kg大豆苷元灌胃，繼續喂養8周后終止實驗。斷髓法處死大鼠，立刻心臟穿刺取血離心后儲存于-80 ℃冰箱，并將腫瘤切除后稱取質量，隨后置于10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片。

1.3 微血管密度MVD的檢測

取大鼠乳腺腫瘤石蠟標本切片，切片厚約5 μm，二甲苯中脫蠟，高溫高壓組織抗原修復，按說明滴加CD34抗體，采用免疫組化SP法檢測腫瘤的MVD。CD34定位于血管內皮細胞胞漿，呈棕黃色。用CD34免疫染色標本切片，標記其中的微血管，以血管內皮細胞胞質內出現棕黃色顆粒為陽性判斷標準。MVD計數：參照Weidner等［9］報道的方法，即先在低倍鏡（40倍）下全面觀察CD34染色陽性的血管，選取腫瘤微血管著色細胞密集的區域，然后在高倍鏡（200倍）下鑒別著色的血管，并計數。隨機選取5個不重復的200倍視野進行計數，求其平均值即為該切片的MVD值。以上免疫組化染色結果均由具備多年病理診斷經驗的技術人員3人參與判定。

1.4 腫瘤細胞凋亡測定

熒光素標記的dUBP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶的作用下，可與凋亡細胞中斷裂的DNA的3'-OH末端連接，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒的說明來檢測凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況。隨機選取5個不重復的視野進行計數及統計分析。細胞凋亡指數用陽性細胞數占細胞總數的百分率計算。

1.5 腫瘤細胞增殖檢測

用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）免疫組織化學檢測細胞增殖。每只鼠處死前2h腹膜內給予50 mg/kg BrdU，BrdU標記的細胞核被抗-BrdU抗體所識別。隨機選取5個不重復的視野進行計數及統計分析。細胞增殖指數用被標記的細胞數占細胞總數的百分比計算。

1.6 血管生成相關因子的測定

取乳腺癌大鼠心臟部位離心血標本。VEGF、bFGF和內皮抑素水平測定用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作。具體步驟：根據說明書分別配制VEGF、bFGF和內皮抑素的標準品濃度，向板孔中依次加入0.1 mL標準品，1孔只加樣品稀釋液作調零孔。酶標板加蓋37 ℃反應90 min。甩去板內液體，用吸紙盡量吸干。再依次向各標準品孔中加入0.1 mL酶標抗體工作液，37 ℃反應60 min。后用0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次約1 min。然后向各標準品孔中依次加入0.1 mL親和素-過氧化物酶復合物工作液，37 ℃反應30 min。再用0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次約1 min。之后向每孔加入90 μL在37 ℃平衡30 min的顯色液，37 ℃避光18 min。隨即每孔加入50 μL終止液，液體由藍轉黃。于酶標儀上測定各孔D（450） 值并記錄相應濃度。所有試驗樣本均重復1次。

1.7 統計學方法

所有數據均使用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料采用方差分析，其中兩兩比較用S-N-K法。以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 大豆苷元對瘤體質量和MVD的影響

與對照組比較，50和75 mg/kg大豆苷元組大鼠瘤體質量較對照組顯著減輕（P＜0.05）。大豆苷元對MVD的影響見圖1。75 mg/kg大豆苷元組的MVD較對照組明顯下降（P＜0.05），其余組的MVD較對照組差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠瘤體質量和MVD的比較±s）

與對照組比較，*P＜0.05.

組

2.2 大豆苷元對大鼠腫瘤細胞凋亡和增殖的影響

與對照組比較，75 mg/kg大豆苷元組的凋亡指數升高（增加了22.5%），差異有統計學意義（P＜0.05）；此濃度組增殖指數雖然降低（減小了8.4%），但差異無統計學意義（P＞0.05）。75 mg/kg組的凋亡/增殖比是對照組的1.5倍，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 大豆苷元對細胞凋亡、增殖和凋亡/增殖比的影響（±s）

與對照組比較，*P＜0.05.

組別凋亡指數（%）增殖指數（%）凋亡/增殖比對照組10. 2± 0. 8 7 4. 7 ± 6 . 20. 14± 0. 03大豆苷元10 m g / k g 9 . 8 ± 0. 7 7 9 . 3± 5. 40. 13± 0. 0325 m g / k g 10. 5± 1. 07 2. 5± 5. 9 0. 16 ± 0. 0250 m g / k g 9 . 5± 0. 9 7 8 . 5± 8 . 30. 12± 0. 017 5 m g / k g 12. 5± 1. 5* 6 8 . 4± 6 . 10. 21± 0. 02*

2.3 大豆苷元對大鼠血液中VEGF、bFGF和內皮抑素表達水平的影響

與對照組比較，25、50和75 mg/kg大豆苷元組大鼠血液中的VEGF水平依次降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05），而50和75 mg/kg組的內皮抑素水平增加，差異均有統計學意義（P均＜0.05）；各組bFGF水平差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表3。

3 討 論

腫瘤的生長依賴于血管的生成最早由Folkman［10］提出，他認為當腫瘤直徑超過2 mm時就需要新生血管形成。腫瘤血管的生成是指腫瘤細胞通過分泌細胞因子誘發毛細血管新生，并最終形成微循環網，是由血管生成刺激因子和抑制因子共同調控的復雜過程。誘導血管的生成是惡性腫瘤無限生長、浸潤與遠處轉移的前提之一，在腫瘤的生長過程中，新生的毛細血管既為腫瘤的生長提供了營養物質，又為腫瘤的遠處轉移準備了條件［11］。因此，如何抑制腫瘤血管生成，是當前腫瘤治療的熱點之一。本研究即是通過抑制大鼠乳腺癌的血管生成，從而抑制乳腺癌的發生發展。

乳腺癌作為一種血管依賴性腫瘤，其生長、轉移和復發受多種細胞因子的調節，目前已知的血管生成刺激因子有VEGF、bFGF、轉化生長因子1（transforming growth factor，TGF-1）、血小板衍生內皮細胞生長因子等［12］，研究發現VEGF是已知最強的促血管生成因 子［13］，也是目前發現的刺激腫瘤血管形成的最關鍵因子，在腫瘤血管生成過程中發揮核心作用［14］；血管生成抑制因子有：內皮抑素、血管抑制素（angiostain）、血小板因子-4（platelet factor-4，PF-4）、干擾素-α（interferon-α，IFN-α）等［12］，其中最重要的是內皮抑素。本試驗中涉及到的細胞因子有VEGF、 bFGF和內皮抑素，通過血管生成刺激因子和血管生成抑制因子來共同調節大鼠乳腺癌的血管生成。

乳腺腫瘤血管的形成首先打破了局部正性和負性調節因子之間的平衡，誘導宿主血管的增殖反應，而增殖形成的這些微血管不同于正常血管，其結構和功能均表現異常，乳腺腫瘤內的血液灌注量分布不均，血液不能正常流動，腫瘤血管壁發育不成熟，通透性較高，且乳腺癌組織內缺乏淋巴管吸收滲出液，致使乳腺癌內形成了間質高壓區［15］。此外，由于間質壓在腫瘤邊緣處急劇下降，導致大量攜帶血管生成因子和腫瘤細胞的間質液從腫瘤邊緣滲漏到周圍正常組織中，從而促進腫瘤的擴散［15-16］。

國內外研究報道，大豆異黃酮抗腫瘤作用的機制有抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，抗腫瘤血管生成等。張學增等［17］通過建立膠原誘導性關節炎大鼠模型，發現染料木素能夠抑制成纖維樣滑膜細胞的增殖；Mizushina等［18］研究發現染料木素通過抑制人類DNA 拓撲異構酶II的活性來抑制癌細胞的增殖；Wang等［19］研究得出染料木黃酮可抑制大鼠動脈平滑肌細胞的增殖。另有研究顯示大豆苷元可誘導腫瘤細胞凋亡，康杰芳等［20］研究發現3'-大豆苷元磺酸鈉對人乳腺癌細胞MCF-7有促凋亡作用；Choi等［21］研究得出大豆苷元促進人類乳腺癌細胞凋亡可能與ERα/C-erbB-2表達有關。本研究發現大豆苷元可通過調節大鼠乳腺癌細胞因子的表達水平，從而抑制乳腺腫瘤的細胞增殖。

近年來，有不少研究發現植物提取物可抑制腫瘤的血管生成。本課題組前期研究［22］通過建立絕經后大鼠乳腺癌模型，發現染料木素可抑制乳腺腫瘤的血管生成；鄭國燦等［23］研究得出牛蒡子苷元對腫瘤血管生成具有抑制作用。而有關大豆苷元與腫瘤血管調節因子和MVD關系的研究還較少，本實驗建立了乳腺癌大鼠模型，得出當大豆苷元的劑量在50 mg/kg以上時，大鼠瘤體質量顯著減輕，大豆苷元的劑量達到75mg/kg時，凋亡/增殖比顯著增加，乳腺腫瘤MVD明顯下降，抑瘤效果更顯著；當大豆苷元劑量在25 mg/kg以上時，隨劑量的增加可下調大鼠乳腺腫瘤中VEGF水平，50 mg/kg以上時可上調內皮抑素水平。提示小劑量的大豆苷元對乳腺腫瘤生長的抑制作用較弱，較高劑量（≥50 mg/kg）的大豆苷元能降低大鼠乳腺腫瘤VEGF水平、增加內皮抑素水平，進而使大鼠乳腺腫瘤的微血管密度下降，可有效抑制乳腺腫瘤生長。

綜上所述，大豆苷元的抑瘤作用與抑制腫瘤的血管生成有關，這為針對乳腺癌血管調節因子的靶向治療提供了新的思路，但是還需要我們深入研究血管調節因子及其受體的調控機制，這些問題的闡明與解決在乳腺癌預防和乳腺癌治療上均具有重要的意義。

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Effect of daidzein on the growth and angiogenesis of breast carcinoma

KANG Xinmei，WANG Hui，WANG Li，TANG Dabei，ZHANG Qingyuan
（Department of Medical Oncology， Tumor Hospital of Harbin Medical University， Harbin 150081， Heilongjiang， China）

目的：利 用7，12-二甲基苯蒽（DMBA）誘導的大鼠乳腺癌模型，探討大豆苷元對乳腺癌腫瘤血管生成的抑制作用及機制。方法：建立DMBA誘導的乳腺癌大鼠模型，隨機分為對照組、10、25、50和75 mg/kg大豆苷元灌胃組，觀察各組腫瘤生長情況，測定腫瘤微血管密度（MVD），并計算各組腫瘤的增殖指數和凋亡指數；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測心臟離心血標本中血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和內皮抑素的水平。結果：與對照組比較，50和75m g/kg大豆苷元組大鼠瘤體質量顯著減輕（P＜0.05），75 mg/kg大豆苷元組的凋亡指數增加，其抑制腫瘤血管生成的效果顯著（P均＜0.05）。與對照組比較，25、50和75mg/kg大豆苷元組的VEGF水平降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05），同時50和75 mg/kg大豆苷元組的內皮抑素水平增加，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。結論：較高劑量（≥50m g/kg）的大豆苷元能使大鼠乳腺腫瘤的微血管密度下降，可有效抑制乳腺腫瘤生長。

乳腺癌；大豆苷元；微血管密度；血管內皮生長因子；內皮抑素

OBJECTIVE:To evaluate the inhibitory effects of daidzein on angiogenesis of breast carcinoma，and to study their anti-cancer mechanisms by using the model of 7，12-dimethylbenz［α］anthraxcene （DMBA）-induced breast carcinoma in SD rats.METHODS：The DMBA -treated SD rats were randomly divided into control，10，25，50 and 75 mg/kg daidzein-gavaged groups. The growth of tumors was assessed in each group. The tumor microvessel density （MVD） was determined，and tumor proliferation index and apoptosis index were calculated. Moreover，vascular endothelial growth factor （VEGF），basic fibroblast growth factor （bFGF） and endostatin levels were measured by ELISA.RESULTS：Compared with the control group，tumor mass was reduced more significantly in the 50and 75 mg/kg daidzein groups （P＜0.05）. The apoptosis index of 75 mg/kg daidzein group was increased，and the effect of inhibiting tumor angiogenesis was significant （all P＜0.05）. Compared with the control group，the VEGF levels of 25，50and 75 mg/kg daidzein groups were all decreased，in a dose-dependent manner（P＜0.05），meanwhile endostatin levels were increased in the 50 and 75 mg/kg daidzein groups，and the differences were statistically significant （all P＜0.05）.CONCLUSION：Higher dose of daidzein （≥50 mg/kg） could decrease MVD of mammary tumor and inhibit the growth of breast carcinoma effectively in rats.

breast c arcinoma；daidzein；microvessel density；vascular endothelial growth factor；endostatin

R737.9

A

1004-616X（2015）01-0016-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.004

2014-09-05；

2014-10-22

黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目（1251G040）

作者信息： 康欣梅，E-mail：kxm791107@163.com；Tel：0451-86298683