脫氧雪腐鐮刀菌烯醇致小鼠畸形骨骼組織差異表達基因及相關通路分析

李 巖，趙英會，莊東明，李曉霞，于愛蓮*

（泰山醫學院基礎醫學院，山東 泰安 271000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇致小鼠畸形骨骼組織差異表達基因及相關通路分析

李 巖，趙英會，莊東明，李曉霞，于愛蓮*

（泰山醫學院基礎醫學院，山東 泰安 271000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是一種主要由禾谷鐮刀菌產生的單端孢霉烯族毒素［1］，它是谷類食物中的一種常見污染源。二十世紀初有報道DON與動物骨骼畸形有關，它能引起鳥類軟骨發育不全，小鼠的胸肋分節不正常等［2］。Collins等［3］研究結果顯示，DON可以引起多個部位的骨化程度下降、胸關節的不合并以及異常等。對于DON引起骨骼畸形的機制研究甚少，僅有Sergeev等［4］進行了初步研究，發現口服DON的小鼠出現體內鈣平衡紊亂。本研究采用具有準確性高、數據可靠、高密度和高通量分析特點的NimbleGen 60mer小鼠全基因組12×135k長寡核苷酸基因表達譜芯片，檢測小鼠正常骨骼組織和畸形骨骼組織基因表達譜的變化。通過基因本體學（gene o ntology，GO）分析軟件，對差異表達基因的生物學功能進行注釋或基因分類，篩選出兩組之間具有顯著性差異的GO條目。通過DAVID database數據庫篩選骨骼組織差異表達基因所涉及到的信號傳導通路，為闡明DON致骨骼畸形的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DON毒素，購自Sigma公司；健康性成熟的昆明小鼠，購自山東大學實驗中心；Trizol試劑盒，購自Invitrogen公司；Mus musculus 12×135k小鼠全基因組寡核苷酸芯片，購自上海康成生物工程有限公司；NimbleGen 芯片雜交試劑盒，購自Roche公司。

1.2 動物模型的建立與取材

取妊娠母鼠30只，隨機分成空白對照組、溶劑對照組、低劑量DON染毒組、中劑量DON染毒組、高劑量DON染毒組共5組，每組各6只，空白對照組不作任何處理。溶劑對照組注射丙二醇和生理鹽水配制的溶劑，3個實驗組分別按4、6.4和10 mg/kg設置DON濃度梯度，于妊娠第7、8、9、10天連續腹腔注射。母鼠妊娠第18天，頸椎脫臼法處死母鼠，剖腹取出胎鼠并去除皮膚與內臟，保留顱骨及脊柱骨架。

1.3 總RNA的提取

取100 mg新鮮椎體骨骼組織樣品，用Trizol法提取總RNA，操作方法按照試劑盒說明書。分光光度儀測定吸光度值D（260）和D（280），計算濃度。

1.4 cDNA基因表達譜芯片

進行cDNA的合成（參照Invitrogen Superscript雙鏈cDNA合成試劑盒），用Nanodrop進行cDNA定量和質控。用NimbleGen單色DNA標記試劑盒Cy3標記已合成好的cDNA標本。然后在標準條件下將標記好的cDNA和cDNA基因表達譜芯片進行雜交（參照NimbleGen芯片雜交試劑盒）。cDNA基因表達譜芯片有44 170個不同的cDNA，以管家基因GAPDH作為內參。雜交信號的熒光強度用GenPix4000B芯片掃描儀進行檢測。

將實驗結果轉換成數字型數據保存，使用GenePix pro V6.0軟件讀取原始熒光值，并對原始數據進行分析運算。用t檢驗篩選兩組之間比較P＜0.05的基因且倍數變化大于2的為差異表達基因，P值越小，越有理由說明該基因在兩樣本間表達不同。

1.5 實時熒光定量PCR

選取對照組和實驗組中與骨骼發育密切相關的6個差異表達基因，GAPDH作為內參，用qPCR驗證芯片結果。總反應體系25 μL，包括dNTP 2.5 μL，cDNA 1 μL，終濃度0.25× SYBR Green 2.5 μL，10 μmol/L正向和反向PCR特異性引物各1 μL，Tap聚合酶1 μL等。反應條件為95 ℃、5 min，然后在95 ℃、10 s變性、59℃、15 s退火，共35個循環，最后72℃ 、20 s延伸。

1.6 差異表達基因的功能分析及通路分析

采用基因本體學（gene ontology，GO）分析軟件，對篩選出的差異表達基因的生物學功能進行基因分類，篩選出在兩組之間具有顯著性差異的GO條目。從生物學過程、分子功能和細胞組分3個方面對基因的功能進行分類。采用Genespring GX軟件和DAVID database 數據庫對上述篩選到的差異基因所涉及到的信號通路進行檢索分析，探討DON致骨骼畸形的分子機制。

2 結 果

2.1 胎鼠骨骼組織差異表達基因的確定

對正常對照組胎鼠和母鼠DON染毒后所產畸形胎鼠椎體骨骼組織中反轉錄后產生的cDNA進行基因芯片檢測發現，在總共的44 170個基因中，篩選出972個差異表達基因，占總數的2.20%，經DON染毒后有445個基因表達下調，517個基因表達上調；差異倍數大于2倍的基因有282個（P＜0.05），其中上調基因134個，下調基因148個。表達上調的基因中與骨骼發育密切相關的有Pax1、Fbn1、Col9a2、Papss2和Lgals3；表達下調的基因中與骨骼發育密切相關的有Runx2、Pthlh、Hexb、s100a9。表達有顯著性差異的基因除了編碼與骨骼畸形有關的蛋白、胚胎畸形有關的蛋白（見表1），還包括編碼與癌癥、血液、炎癥、神經系統等有關的蛋白以及未知功能的蛋白。

2.2 實時熒光定量PCR驗證結果

在小鼠胚胎骨骼組織差異表達的基因中，隨機選取6個基因Pax1、Runx2等做qPCR檢測，發現上調基因和下調基因的變化趨勢和cDNA微陣列的變化趨勢一致，見圖1。

2.3 差異表達基因的功能分析結果

通過GO分析發現，對照組和實驗組椎體骨骼組織中差異表達的基因，有32.80%與生物過程有關，32.80% 與細胞組分有關，另有35.18%與分子功能有關。三方面中各亞層次所占比例見圖2～圖4。

2.4 差異表達基因信號傳導通路分析結果

經DAVID database數據庫分析共涉及信號傳導通路153個。篩選出骨骼樣本差異表達基因通路分析結果中富集程度在前10位的通路與基因，見表2。在所涉及通路中已知與骨骼發育相關的差異表達通路為P53、MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway、Cysteine and methionine metabolism、Notch、Jak-STAT signaling pathway、PPAR signaling pathway、Terpenoid backbone biosynthesis、Insulin signaling pathway、Calcium signaling pathway、Hedgehog signaling pathway等。上述通路中所涉及重要基因WNT10B，IKbKb，FGF11等表達明顯子異常。

3 討 論

骨骼組織的發育受到多種基因的調控，一旦基因在自我更新的過程中受到外界物理、化學和生物因素的影響后基因的表達發生改變，導致骨骼發育異常。目前表達譜基因芯片在動物基因組和毒理基因組學中發揮重要作用。近年來有報道用基因芯片技術研究氟中毒對骨骼發育的影響，但DON 作為導致骨骼畸形的一個生物因素，其分子機制尚未見報道。

本研究應用基因本體學對差異表達基因的生物學功能進行注釋和基因分類，在生物過程中，生物調節相關的差異表達基因占18%，包括細胞周期代謝過程的調節、大分子代謝過程的調節和基因表達調節等，這提示DON影響細胞代謝過程和骨骼發育基因的異常表達，導致骨骼發育異常。而在分子功能中發現，36%的差異表達基因與結合有關，主要為蛋白結合、離子結合與陽離子結合等。早在90年代Sergeev等［5］就證明口服DON可導致小鼠體內鈣平衡紊亂。DON可能通過改變Ca2+濃度，造成成骨細胞增殖異常，出現骨骼發育障礙。

在差異表達的基因中Pax1編碼的蛋白質可作為上游主調控因子在多個細胞信號傳導通路中起重要作用。在胚胎發育過程中可調控細胞分化、更新和凋亡。即使對一些已經發生特定分化的細胞，對其細胞功能的保持也起到重要調控作用［5］，目前研究表明，Pax 基因的非正常表達會導致多種器官組織發育畸形［6］。 在敲除Pax1和Pax9基因的小鼠胚胎發育過程中完全觀察不到脊柱形成，Pax1或Pax9單個基因缺失的小鼠胚胎表現為不同程度的脊柱畸形［7-8］。本研究結果顯示，Pax1基因表達上調2.548倍，差異顯著，經RTPCR檢測發現，DON作用于成骨細胞使Pax1基因表達上調，其mRNA轉錄水平增加，以此推論DON導致的骨骼畸形可能與Pax1基因表達上調有關。

Runx2基因是成骨細胞內的特異性轉錄因子，其功能主要是促進成骨細胞的分化和抑制成骨細胞成熟，Enomoto等［9］使用 Runx2基因缺陷的小鼠為研究對象，發現Runx2缺失使小鼠顱骨細胞無法分化為成骨細胞。Takeda等［10］使用轉基因小鼠研究發現，Runx2可以促使軟骨細胞發育成熟，使用顯性負突變的DNRunx2抑制了軟骨細胞的成熟。本研究顯示DON處理后Runx2基因表達下調2.269倍，且小鼠成骨細胞內Runx2基因隨著DON濃度的增加，表達量明顯降低。小鼠成骨細胞在DON的影響下，周期分布改變，凋亡率增加，Runx2基因表達下調，可導致小鼠出現骨骼畸形，為今后DON致畸的研究以及臨床治療提供了理論依據。

差異表達基因信號傳導通路分析結果表明，未發現已知的與骨骼發育密切相關的BMP信號通路，而癌癥發生通路富集基因最多，共有15個差異基因，幾個重要的與骨骼發育、成骨細胞分化等有關的基因如PRKCA、FGF、WNT10B和MAPK8均為下調基因，說明DON影響許多相關基因的共同改變才可以產生細胞表型效應。該信號傳導通路在DON致骨骼畸形中的作用機制有待深入研究。

其中P53作為抑癌基因，P53蛋白在調節細胞增殖、DNA修復和凋亡等過程中起關鍵作用。有研究表明P53與調節成骨細胞分化、骨骼形成有關，P53通過DNA結合依賴的最小啟動，抑制osterix的轉錄，P53缺失小鼠增加巨噬細胞集落刺激因子，有利于成骨細胞的分化［11］。本研究表明，DON影響P53信號途徑中共涉及8個基因，6個上調基因，只有STEAP3和PTEN為下調基因，在上調基因中Gadd45b，差異近2倍，為已知的P53應答基因，其產物過表達引起細胞周期在G1期停滯。下調2.2倍的PTEN基因10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物，是一個重要的抑癌分子，位于10q23.3，轉錄產物為515 k b的mRNA。其蛋白產物有一酪蛋白磷酸酶的功能區和約175個氨基酸左右的與骨架蛋白tenasin，auxilin同源的區域。PTEN基因可能通過去磷酸化參與細胞調控。其可能與酪氨酸激酶競爭共同的底物，在腫瘤的發生，發展中起重要作用。P53蛋白是脊柱動物DNA損傷響應調控因子，有研究證明，DON可導致DNA斷裂和損傷［12］，DNA鏈斷裂是P53依賴性細胞凋亡的誘因之一，骨組織細胞凋亡導致骨骼發育異常。PTEN在骨代謝調控和骨穩態維持中具有重要的作用，PTEN基因敲除導致骨質硬化癥［13］。P53如何對PTEN的功能失調產生應答需進一步研究。

Wnt信號通路通過調節胚胎期軟骨發育，以及出生后軟骨發生、成骨細胞和破骨細胞生成、軟骨內成骨、骨重塑、骨折修復等過程，調控骨骼系統相關疾病和骨代謝。近年研究表明，Wnt通路在人類胚胎發育、細胞增殖與分化、腫瘤發生、骨關節系統疾病中發揮重要作用［14］。其通過在細胞分化不同階段的正向和負向調控機制，保證了軟骨細胞在特定位置以合適的速率穩定有序分化。在Wnt家族及其作用途徑的相關信號分子中，無論何種分子和亞型的異常表達都可能破壞Wnt系統維系的正負平衡機制，導致骨骼系統畸形。本研究發現，DON致胎鼠畸形骨骼組織中Wnt信號的改變涉及10個基因，其中5個上調，5個下調，重要的基因Wnt10b下調1.7倍，有研究表明Wnt10b的信號抑制脂肪細胞并刺激造骨細胞生長，即減少脂肪，增加骨骼［15］。實驗發現，骨髓中Wnt10b的高水平表達能直接增加小鼠骨頭的密度和重量。且研究確定出調節骨骼形成的Wnt家族中的一種特殊信號蛋白的功能。

總之，我們首次通過cDNA基因芯片高通量的篩選DON引起小鼠骨骼組織差異表達基因。本研究通過對上述差異基因的通路分析，經DAVID database數據庫篩選共涉及通路153條，其中與骨骼發育密切相關的共8條，并對其與骨骼發育過程中的相關關系進行分析，探討DON可引起骨骼畸形通路的相關基因及其功能，為深入研究DON引起骨骼畸形的分子機制奠定了理論基礎。

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Differential gene expression and related pathways of skeletal malformations induced by deoxynivalenol in mice

LI Yan，ZHAO Yinghui，ZHUANG Dongming，LI Xiaoxia，YU Ailian*
（School of Basic Medicine Sciences， Taishan Medical University， Tai’an 271000， Shandong， China）

目的： 篩選脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）致小鼠胚胎畸形骨骼組織的差異表達基因及相關信號傳導通路，從基因水平上闡明DON致小鼠骨骼畸形的分子基礎。方法：取孕期小鼠30只，隨機分成3個不同濃度DON染毒組、溶劑對照組和空白對照組，每組6只，將DON染毒組孕鼠于孕期第7～10天連續腹腔注射DON，染毒后第18天麻醉剖腹取出胎鼠骨骼組織，提取椎骨骨骼組織總RNA，通過反轉錄法獲取畸形骨骼組織和正常對照組骨骼組織的cDNA，并對其分別進行熒光標記，采用全基因組芯片技術對小鼠胚胎畸形骨骼組織與正常對照組織的差異基因表達譜進行分析，采用基因本體學分析軟件對差異表達基因進行功能分析，DAVID database數據庫篩選差異表達基因涉及的信號通路，并利用熒光定量PCR（qPCR）技術對基因芯片結果進行驗證。結果：在DON染毒組小鼠全基因組芯片上篩選出差異基因282個，其中下調148個，上調134個；在差異表達基因分析的基礎上，發現差異表達基因涉及到的通路有153個。qPCR結果表明，上調基因Fbn1、Co19a2、Papss2、Pax1F和下調基因Runx2、Pthlh等6個差異表達基因的相對定量結果與基因芯片檢驗結果表達趨勢一致。結論：應用基因表達譜芯片初步篩選出DON所致胎鼠畸形骨骼與正常胎鼠骨骼組織中的差異表達基因，并通過通路分析發現，上述差異表達基因涉及多條信號傳導通路。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；骨骼畸形；基因芯片；差異表達基因；傳導通路

OBJECTIVE:To screen the differential gene expression and related pathways of fetal skeletal malformations induced by deoxynivalenol（DON） in mice，and to explore the mechanism of deformities induced by DON at the molecular level.METHODS：30 pregnant mice were randomly divided into 3 experimental groups and 2 control groups，6 in each group. DON injection was performed from days 7 to 10 of pregnancy by intraperitoneal injection into pregnant mice. At GD 18，all mice were killed under isoflurane anesthesia，and vertebral bone tissue of fetuses were collected. Total RNA of vertebral bone tissues was extracted and cDNA was obtained by RT-PCR. Using whole genome microarray technology，the gene expression profiles and the pathways of the rat vertebral bone tissue were studied. Analysis of the function of differentially expressed genes was performed by using software of gene ontology. Screening signaling pathways of differentially expressed genes was done by DAVID database. The results were verified by fluorescence quantitative PCR（qPCR） technology.RESULTS：Microarray analysis showed that 282 genes，including 148 downregulated and 134 up-regulated genes，were abnormally expressed in fetal vertebral bones after maternal DON exposure. 153 pathways were related to the differentially expressed genes. The relative quantitative results of qPCR were consistent with the results of gene chip test in Fbn1，Co19a2，Papss2， Pax1，Runx2 and Pthlh genes.CONCLUSION：There were differential gene expressions in deformed fetal skeleton between deoxynivalenol-treated rats and normal rats，involving multiple signaling pathways. The differentially expressed genes and signaling pathways may be related to themolecular mechanisms of deformities induced by DON.

deoxynivalenol；skeletal d eformities；gene c hip；differentially e xpressed g enes；signaling p athways

Q344*.13

A

1004-616X（2015）01-0001-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.001

2014-05-11；

2014-01-06

山東省科技攻關項目（2007GG30002016）；國家傳染病重大專項合作項目（2009ZX10004-216）；山東省自然科學基金（ZR2013HL060）

作者信息：李巖，E-mail：liyan2313935@163.com。*通信作者，于愛蓮，E-mail:alyu@tsmc.edu.cn