節能型海帶育苗新技術——黑暗流水儲存配子體

梅俊學, 侯旭光, 李信華

(1.山東大學(威海)海洋學院, 山東 威海 264209; 2.尋山集團有限公司, 山東 威海 264316)

目前的海帶夏苗的室內培育是一種集約式的生物培養方式。這種方式在海帶夏苗生產上, 關鍵是低溫條件。低溫加上較弱的光照, 可以抑制雜藻的繁生,防止某些病害的發生, 并控制海帶幼體的生長, 以待自然水溫的下降。所以在育苗生產中給予幼苗的低溫并不是其生長發育所需要的最適溫。如果生產上能給予幼苗最適培養條件, 從采孢子到孢子體達到1~2 cm的出庫標準, 大體只要45 d左右時間。但如果8月上旬采苗后, 在最適條件進行培養, 那么到9月下旬, 幼苗就能長到出庫大小。但是, 這時正是自然水溫的高溫期。自然水溫要下降到幼苗能出庫所要求的19℃以下, 在北方海區最早也要到l0月中旬。幼苗既然不能出庫下海暫養, 室內培育條件又滿足不了幼苗生長的需要, 就可能發生爛苗。所以在現行的海帶夏苗培育方法中, 不得不用低溫控制幼苗的生長, 減少病害的發生[1-5]。

為解決以上幾個問題, 20世紀80年代孫國玉等試驗了“改進的海帶夏苗培育法”。當幼苗發育到一定時期, 將苗簾放在-1~4℃的低溫靜水中, 保存20~70 d。取出后在流水的育苗室內培育。這種方法的優點是,在低溫儲藏時期無需換水, 因此節約了用于降溫的電費、化肥以及人工。但是由于投資大、操作繁瑣等缺點, 這項技術沒有被生產企業采用[6-9]。

“海帶配子體克隆育苗技術”可在一定程度上解決降溫成本問題。此項技術包括大規模培養配子體、配子體切段、配子體附著、幼苗培育等步驟。這種育苗方法具有品種純度高、育苗時間短、不受季節限制、成本低等優點。但是仍有一些技術難點, 如克隆大量配子體需要的純凈海水、快速配子體克隆分離、附苗方法、發育誘導等, 制約了該技術的廣泛應用[10-12]。

本項目研究的方法通過完全閉光來抑制配子體生長發育, 能夠有效解決上述問題。無需另建冷庫,利用現有的育苗設施, 在海帶育苗中的適當時間,將苗簾集中存放, 將育苗水溫從 6.5~8.0℃提高到10.0~10.5℃, 從而達到節約能源、節約人工的目的。

1 材料與方法

本試驗的材料是山東威海各海帶育苗場普遍選用的雜交品系, 當地俗稱“笨牛”。附著基為山東普遍使用的紅棕繩簾和福建普遍使用的維尼綸簾。試驗地點在尋山集團有限公司所屬青漁灘海帶育苗車間。本車間育苗能力1億株, 共13排串聯的育苗池,每排3個池, 每池150~160個育苗簾。在其他試驗中,為了將試驗池水溫調節至高于其他池, 將室內靠東面的一排池的供水渠截開, 成為專用供水池。池內水流部分來自經過沉淀、過濾、制冷和添加營養鹽后的海水, 水溫6.5~8.0 ℃, 與其他普通育苗池所用海水相同, 另一部分海水是直接從海區抽取的自然海水, 水溫 22~27℃, 使試驗用供水池的水溫調節至(10±1)℃。

由于海帶的配子體微小, 雌配子體只有一個細胞, 直徑11~22 μm, 雄配子只有6~8個細胞組成, 而且聚集在一起, 很難準確計數。所以用它們產生的幼孢子體, 即海帶苗的數量代表配子體的成活率。每次試驗結束時, 從育苗簾上隨機剪取 1 cm苗繩 9段,計數大于 0.2 cm的健康苗, 數據用 SPSS進行ANOVA分析。

1.1 靜水黑暗條件下維尼綸和紅棕繩簾上儲存配子體

2009年 8月 13日隨常規生產采孢子, 密度為160倍顯微鏡視野中 15~20個游動孢子, 在 8℃、800~2 000 lx光照強度下培育配子體。至第12天時,取紅棕繩和維尼綸簾各12張, 折疊后分別放入6個體積50 L的塑料桶中, 每桶4張簾子, 桶內注滿6.5℃育苗用海水, 加蓋, 然后將塑料桶置于(6±0.5) ℃儲水池中。在這樣的黑暗靜水條件下儲存14 d后, 在傍晚將簾子移回常規海帶育苗池內。恢復光照后的前3天維持800~1 500 lx的弱光照, 隨后的光照強度隨育苗庫內其他苗簾一起調節, 一般為 1500~4000 lx,育苗池內的流動海水溫度在6.5~8℃。直至10月12日測量和記錄孢子體苗平均長度和密度。同一育苗庫內的其他苗簾作為對照組, 它們均沒有經過黑暗處理, 始終在流水的育苗室內。在試驗組黑暗處理期間, 對照組水溫6.5~8.0℃, 光照強度800~2 000 lx。試驗總共持續60 d。

1.2 流水黑暗條件下紅棕繩簾上儲存不同發育時期的配子體

試驗組紅棕繩簾150張, 分別在3個育苗池中,每池50張。2010年8月11日, 隨常規生產采孢子, 密度為 160倍顯微鏡視野中 15~20個游動孢子, 在(10±0.5)℃、500~2 000 lx光照強度下培養。培育至第6天、第8天和第10天時, 分別將一個池內的50張簾子垛疊 3~4層, 然后用兩層黑色塑料布將育苗池覆蓋, 使附著在苗簾上的配子體處于黑暗、流水環境中, 水溫(10±0.5)℃。14 d后, 在傍晚移除黑塑料布, 將堆放的苗簾分散放回原來的水池中, 使黑暗處理過的配子體次日開始接受光照, 光照強度在初始的3天內從500~750 lx提高到1500~2000 lx, 隨后的光照強度隨苗庫內其他苗簾一起調節, 一般為1 500~4 000 lx, 育苗池內的流動海水溫度在10~11℃。直至10月12日測量和記錄孢子體苗平均長度和密度。對照組培育條件同1.1。

1.3 紅棕繩簾上配子體在流水黑暗條件下儲存不同時間

黑暗處理開始時間為采孢子后第 8天, 黑暗處理時間為12、14和16 d, 其他條件與1.2相同。

1.4 流水黑暗條件下儲存配子體用于規模育苗生產

2013年 8月 13日做中試規模試驗, 紅棕繩簾2000張, 采孢子后第 8天時開始黑暗處理, 處理時間12 d, 其余操作同1.2。至10月12日試驗結束。

2 結果

2.1 靜水條件下維尼綸和紅棕繩網簾黑暗儲存配子體

黑暗儲存結束時在顯微鏡下觀察發現, 維尼綸簾配子體色素褪去, 但是細胞結構仍完整; 紅棕繩簾上的部分配子體失去色素, 結構完整; 部分配子體解體死亡。恢復光照后第4天, 配子體的色素重新出現。恢復光照8 d時, 幼孢子體出現在苗簾上。試驗結束后時, 兩種育苗器上的海帶苗(≥0.2 cm)平均密度分別為49株/cm和19株/cm, 而對照組為54株/cm,方差分析表明, 三者的差異顯著(表1)。

表1 紅棕繩和維尼綸育苗簾黑暗靜水中存儲配子體后出苗數以及方差分析Tab.1 Sporeling density (sporelings/cm rope) of gametophytes treated in dark on palm and synthetic panels and results of one-way ANOVA

2.2 流水黑暗條件下紅棕繩簾上儲存不同發育時期的配子體

黑暗處理開始時配子體分別為6 d、8 d和10 d,它們分別代表未成熟(即仍處于營養生長階段)、部分成熟(部分處于營養生長階段, 部分開始生殖階段,偶爾見幼孢子體)和成熟(大部分配子體進入生殖階段, 幼孢子體在每個顯微鏡視野中均可見到)的配子體。盡管在黑暗處理后配子體失去色素, 但是僅有少量配子體死亡。恢復光照第8天時, 在3個試驗組的苗簾上都出現幼孢子體。試驗結束后時, 3組處理的苗簾上幼苗(≥0.2 cm)的平均密度分別為 59株/cm,64株/cm 和 58株/cm, 而對照組為61株/cm。方差分析表明, 3個試驗組和對照組的差異不顯著(表2)。3組均達到國家GB/T 15807-1995三類苗簾標準。

表2 不同發育時期的配子體在黑暗處理后出苗數以及方差分析Tab.2 Sporeling density (sporelings/cm rope) of gametophytes treated in dark for 14 days at different developmental stages and results of one-way ANOVA

2.3 紅棕繩簾上配子體在流水黑暗條件下儲存不同時間

試驗結束后時, 3組處理的苗簾上幼苗(≥0.2 cm)的平均密度分別是66株/cm, 64株/cm, 47株/cm, 而對照組為61株/cm。方差分析表明, 3個試驗組和對照組的差異顯著(表3)。黑暗處理時間16 d的一組大于0.2 cm的苗少, 只有47株/cm, 但是小于0.2 cm的幼苗高達51株/cm。黑暗處理12 d和14 d的苗簾達到國家GB/T 15807-1995三類苗簾標準。

表3 黑暗處理配子體不同時間后出苗數以及方差分析Tab.3 Sporeling density (sporelings/cm rope) of gametophytes treated in dark for 12, 14 and 16 days at 8th day of development and results of one-way ANOVA

2.4 流水黑暗條件下儲存配子體用于規模育苗生產

幼苗(≥0.2 cm)平均 82 株/cm, 幼苗(≥1.5 cm)平均18株/cm, 所有苗簾均達到國家GB/T 15807-1995二類苗簾標準。

3 討論

從表1可以看出, 即使在靜水中, 海帶配子體也具有忍受黑暗的能力, 本項結果與海帶屬其他種的研究結果相似[13]。但是與維尼綸簾相比, 紅棕繩簾上配子體的存活率較低, 可能是紅棕繩中的滲出物對海帶配子體產生了傷害。在試驗2的流水條件下, 滲出物被水流帶走, 因此配子體得以存活。

表2、表3和規范育苗生產結果表明, 在流水條件下, 12 d和 14 d的黑暗處理、育苗水溫提高到(10±0.5)℃, 對配子體的存活、發育以及形成孢子體的能力并沒有顯著的不利影響。這樣的配子體能夠培育出合格的海帶夏苗。黑暗處理16 d時, 因為在光照下培育時間過短, 導致孢子體沒有足夠時間發育至國家標準要求的長度。

根據上述研究結果, 可以將現行的海帶育苗過程做如下改進: (1)按常規方法采孢子; (2)整個育苗過程的水溫從目前的6.5~8℃提高到(10±0.5) ℃; (3)在采孢子8 d后, 將苗簾集中存放, 3~4層為一疊, 加蓋黑色塑料布遮光; (4)黑暗處理12~14 d后, 在傍晚移除覆蓋物。恢復光照后的頭 3天緩慢提高光照, 從500~750 lx提高到1 500~2 000 lx; (5)其他管理措施同傳統育苗方法。

改進后的技術有以下優點: (1)育苗水溫從6.5~8℃提高到 10℃, 因此節約制冷費用; (2)黑暗儲存配子體時, 苗簾3~4層垛疊擺放, 因此可以節約2/3到3/4的用水量; (3)儲存期間無需人工管理, 因此節約人工; (4)沒有復雜的操作和技術, 容易掌握; (5)不需要另加投資。該技術的創新點: (1)模仿海帶在自然界的生活環境, 是本技術依據的理論基礎。自然海水中海帶放散孢子在春季和秋季, 水溫為 10~20℃, 孢子的萌發和配子體的形成和發育也在這個溫度范圍內。但是由于配子體生長緩慢, 而且是在水平面上生長,容易被生長較快且直立生長的海藻如水云、滸苔等覆蓋, 不能得到足夠的光照而停止發育, 也可以說進入休眠狀態。等到晚秋, 當覆蓋的雜藻死亡并流失后, 海帶配子體才有機會得到光照, 恢復生長和發育。在被覆蓋期間, 配子體所處的條件是流水、黑暗。這是本技術的理論核心。(2)與孫國玉等的“改進的海帶夏苗培育法”相比。此方法的理論基礎是, 生活在極地海洋里的海帶類的藻體, 由于低溫(-1.6~4℃),它們的代謝作用進行的極端緩慢, 在漫長昏暗的極夜期間存活著, 待極晝到來時又繼續旺盛地生長繁殖。因此, 這種方法建議, 將配子體移入0~-2℃的靜止海水中置冷庫存儲 20~120d或 8℃儲存 20~30d。在海帶苗出庫下海前約50d, 由冷庫移入育苗庫中按常規育苗法培育成合乎標準的幼苗。本方法的重點是低溫、靜水和無光。但存在的問題是: ①處理后的配子體仍移回育苗庫按常規的育苗法培育, 即 6.5~8.5℃培育約40~50 d, 仍需要昂貴的降溫費用。②對苗簾的潔凈度要求較高。因為在靜水中儲存, 積累有害物質是不可避免的, 因此在采集孢子前, 需要對紅棕繩苗簾進行額外的處理。③需要將苗簾在育苗庫和冷庫間搬運, 增加了人工。④低溫、靜水不符合海帶在自然條件下的生活狀態。在海上, 海帶自然放散孢子并形成的配子體的季節是春季和秋季, 自然水溫是15℃左右, 而且是流水條件。因此低溫靜水條件下配子體存活率較低。⑤另外建冷庫, 額外投資較大, 而且冷庫利用率低, 每年只有兩個月時間有用[6-9]。(3)與海帶配子體克隆育苗技術相比。此方法的理論基礎是, 分離后單獨培養的雌、雄配子體都能形成無性繁殖系(克隆), 即絲狀體。將大量單獨培養的雌雄絲狀體切碎后混合培養, 仍然會分別產生雌雄配子, 并受精后形成孢子體, 也就是海帶幼苗。這項技術存在的問題是: ①培養條件導致配子體畸形發育。在正常條件下雌配子體是單細胞, 而雄配子體是由少數細胞組成的簡單絲狀體。在人工的雌雄配子體分離培養條件下, 都長成復雜的分枝體和簇狀體, 甚至發生孤雌生殖或孤雄生殖, 并可能染色體加倍。這樣很難得到大量正常健康的配子體和孢子體幼苗。②畸形的配子體導致附苗不牢固, 不均勻。③目前的配子體克隆分離、發育誘導技術都還不成熟, 需要進一步完善[10-12]。

[1]曾呈奎, 孫國玉, 吳超元.海帶的幼苗低溫渡夏養殖試驗報告[J].植物學報, 1955, 4(3): 255-264.

[2]曾呈奎, 吳超元, 孫國玉.溫度對海帶孢子體的生長和發育的影響[J].植物學報, 1957, 6(2): 103-130.

[3]曾呈奎, 吳超元, 任國忠.溫度對海帶配子體生長發育的影響[J].海洋與湖沼, 1962, 4(1-2): 22-28.

[4]Lüning K, Pang S J.Mass cultivation of seaweeds:current aspects and approaches[J].Journal of Applied Phycology, 2003, 15: 115-119.

[5]單體鋒, 劉峰, 劉啟順, 等.海帶幼苗低溫渡夏技術的回顧與展望 [J].中國農業科技導報, 2011,13( 2) : 129-134.

[6]孫國玉.改進夏苗培育法的建議[J].福建水產科技,1981, 1: 35-36.

[7]孫國玉, 楊振芝, 沈世澤.改進的夏苗培育法研究——再論海帶育苗系統中脫苗和爛苗原因分析及其預防措施[J].海洋科學, 1984, 3: 38-42.

[8]孫國玉, 沈世澤, 楊振芝, 等.改進的夏苗培育法研究——三論海帶育苗系統中脫苗和爛苗原因分析及其預防措施[J].海洋科學, 1986, 10(5): 24-27.

[9]繆國榮, 陳家鑫, 劉啟順.一碘苯氧乙酸在海帶夏苗培育中的應用[J].水產學報, 1983, 7: 25-30.

[10]李志凌, 張全勝, 楊迎霞, 等.海帶配子體克隆大規模培養術的研究[J].齊魯漁業, 2003, 5: 1-3.

[11]李大鵬, 吳超元, 劉晚昌, 等.海帶單倍體無性繁殖系育苗技術的研究[J].海洋學報, 2003, 25(5):141-145.

[12]張全勝, 唐學璽, 張培玉, 等.海帶配子體克隆育苗生產中采苗技術的研究[J].高技術通訊, 2005, 15(1):89-92.

[13]Lüning K.Critical levels of light and temperature regulating the gametogenesis of three Saccharina species (phaeophyceae) [J].Journal of Phycology, 1980, 16:1-15.