黑曲霉產纖維素酶發酵條件的優化及酶學性質研究

張曈 劉曉燕 許家興 李登超 羊燕燕

（江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室 江蘇省區域現代農業與環境保護協同創新中心 淮陰師范學院 江蘇淮安 223300）

黑曲霉產纖維素酶發酵條件的優化及酶學性質研究

張曈 劉曉燕 許家興 李登超 羊燕燕

（江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室 江蘇省區域現代農業與環境保護協同創新中心 淮陰師范學院 江蘇淮安 223300）

本文用單因素實驗和響應面法對黑曲霉B3菌株產纖維素酶培養條件進行了優化，確定了黑曲霉B3產纖維素酶的最優條件：小麥秸稈2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，發酵時間73.08h，接種量為8.004%，150 r/m in振蕩培養，此條件下黑曲霉B3發酵液的FPA酶活力為153.4 U/m L。將粗酶液初步純化后，對純化纖維素酶的酶學性質進行了初步研究，確定了其最適溫度為60℃，最適pH值為6.0，Ca2+、Li+、K+等金屬離子對其有激活作用，苯甲基磺酰氟（PMSF）對該酶強烈抑制，該酶對底物CMC的Km值和Vmax分別是24.0mg/m L和0.09mg/min。

黑曲霉；纖維素酶；液體發酵；優化；響應面法

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一種復合酶,主要包括內切葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。利用纖維素酶可開發豐富的纖維素資源,纖維素酶在生物質能源、秸稈綜合利用、可再生資源、食品、飼料、釀造等領域都有廣泛的應用前景[1～3]。然而，就目前而言，纖維素資源的利用率低，同時還會對環境會造成一定污染。因此，如何成功的開發這一資源，對解決人類面臨的能源問題、環境問題、可持續發展都具有非常重要的意義[4]。

通過纖維素酶降解纖維素的研究和應用進展快速，商業化程度較高[5]。纖維素酶的工業化生產可分為固體發酵法和液體深層發酵法，液體深層發酵法的培養條件不易污染雜菌，容易控制，生產效率也較高，被國內外重要的研究和生產工藝廣泛應用[6-7]。黑曲霉作為一種自然界中常見的絲狀真菌，是公認安全的真核微生物。用其生產酶制劑安全、高效、無毒素產生，而且黑曲霉生長期短，產酶速度快，生產的纖維素酶主要分泌到細胞外，便與純化[8]。發酵條件的優化是當前增加纖維素酶活力、提高產酶量的主要途徑之一[9]。對發酵條件進行優化一般采用單因素優化和正交實驗優化，但它們都有一定的局限性，無法直接找到區域中各個因素的最佳組合和響應值的最優值[10]。借助design expert統計軟件能迅速、可靠、簡易地進行優化試驗的安排和數據分析，從而找出微生物培養條件的最佳組成[11]。本文利用design expert8.06軟件對黑曲霉產纖維素酶的液體發酵條件進行優化，并將最優條件下生產得到的纖維素酶進行初步純化，研究其酶學性質，為黑曲霉大規模發酵生產纖維素酶和纖維素酶在生產中的應用打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉B3菌株，實驗室保藏

1.1.2 培養基

固體培養基（平板、斜面）:馬鈴薯20g,葡萄糖2g,瓊脂2g,PH自然種子培養基：PDA液體培養基發酵培養基[13]：液體發酵培養基(質量分數):碳源5%、氮源1%、KH2PO40.05%、Mg SO47H2O 0.05%。

將上述所有培養基均在1.0×10Pa、121℃滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 培養

種子活化：在平板上劃線，挑取單菌落接種到斜面培養基中，置于30℃培養4～5 d。種子液培養：250mL三角瓶裝入種子培養基50mL，接入菌種三環,轉速150r/min，30℃下振蕩培養72h～168h。

發酵培養：5%～10%接種量，28℃～32℃，150r/min振蕩培養60h～96h，制備粗酶液。

1.2.2 粗酶液制備

發酵液先初步過濾，再經5000r/min離心10min，上清液即為粗酶液。酶活測定時需用磷酸緩沖液做適當稀釋。

1.2.3 酶活測定

1.2.3.1 羧甲基纖維素酶活（CMC）測定

實驗組加入適當稀釋的粗酶液0.5mL和0.5%CMC溶液1.5mL，空白對照管中加入2.0mL 0.5%CMC溶液。60℃水浴保溫30min。向試管中加入3.0mLDNS試劑，沸水浴10min，540 nm測吸光值。酶活力單位規定：每mL酶液1min水解底物產生1m g葡萄糖的酶活力為1個活力單位(U/mL)。

1.2.3.2 濾紙酶活（FPA）測定

實驗組取適當稀釋的粗酶液0.5m l，加入PH 4.0的檸檬酸緩沖液1m l，空白對照組加入PH 4.0的檸檬酸緩沖液1.5ml，將實驗組和空白對照組中在60℃水浴中預熱2～3min，再在每個管子內加入50mg的濾紙條30min后加入3mlDNS試劑，立即轉入沸水浴5min后，浸入冷水快速冷卻，在540 nm測定吸光值。每mL酶液1min水解底物產生1m g葡萄糖的酶活力為1個活力單位(U/mL)。

1.2.4 黑曲霉B3產纖維素酶條件優化

前期通過單因素實驗來確定發酵培養基的最佳的碳源、氮源、培養溫度和最佳產酶時間，以便得到最有利于產酶的培養條件。

后期在初步優化的產酶培養基的基礎上，通過design expert8. 06軟件來進行設計，利用Plackett-Burman設計從經初步優化的培養基成分、培養條件中篩選出對酶活具有顯著影響的3個因素，之后針對這3個顯著影響因素以及它們的正負效應進行設計，利用最陡爬坡實驗逼近響應值（最大酶活力區域），最后用響應面法設計進行試驗。通過實驗數據擬合響應面模型，最終確定最優產酶條件，并進行驗證。

1.2.5 纖維素酶的分離純化

發酵液使用硫酸銨分級沉淀，將40%-50%濃度沉淀部分（含有纖維素酶活部分）使用14kD的透析袋進行透析；透析液在濃縮儀上濃縮后采用SephadexG75進行凝膠過濾，活性部分使用陽離子交換柱進一步純化。脫鹽后能夠得到純度較高的纖維素酶組分。

1.2.6纖維素酶酶學性質研究

對纖維素酶進行酶學的理化性質研究，測算纖維素酶的酶活力、最適酶活溫度、pH值、酶失活的溫度范圍，以及酶的米氏常數和最大反應速度等具體生化指標。

2 結果與討論

2.1 黑曲霉B3產纖維素酶條件的優化

通過單因素實驗和響應面實驗（圖1）分析結果表明，優化后的產纖維素酶液體發酵條件為：小麥秸稈2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，發酵時間73.08h，接種量為8.004%，150r/min振蕩培養。在此條件下，做3組驗證實驗，得到濾紙酶活力的平均值為153.4U/m l，比初始酶活力73.5U/m l提高了108%。

2.2 纖維素酶的初步純化

在利用Sephadex G75凝膠柱純化纖維素酶的過程中，每一步都測定洗脫液的纖維素酶活力和總蛋白含量，確定純化過程中纖維素酶回收率和純化程度，結果見表1。純化后的纖維素酶與粗酶液對比，純化倍數2.4倍，回收率43.2%。

表1 纖維素酶的純化步驟

2.3 純化的纖維素酶酶學性質的研究

2.3.1 純化纖維素酶的最適反應溫度

將純化的纖維素酶樣品分別在30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0℃下測定其酶活，結果如圖2所示，從圖中可以看出，純化纖維素酶在60℃時酶活力最高，具有一定的熱穩定性。

圖2 純化纖維素酶的最適溫度（■）和溫度穩定性（◆）

2.3.2 純化纖維素酶的最適反應pH值

將純化的纖維素酶在不同pH（4.0～9.0）下測定其酶活，結果如圖3所示，從圖中可以看出此菊粉酶在pH值為6.0時酶活達到最高，酶活力在pH5.5～7.0之間保持穩定。

圖3 pH值對純化的纖維素酶活力（◆）與穩定性（■）的影響

圖4 不同金屬離子對纖維素酶活性的影響

2.3.4 蛋白抑制劑對純化纖維素酶酶活的影響

將純化的纖維素酶加入碘乙酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、EGTA（乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸）、SDS（十二烷基磺酸鈉）和PMSF（苯甲基磺酰氟）等蛋白抑制劑后在4℃下放置30min，測定酶活，結果如圖5所示。從圖中可以看出，當存在EDTA時，由于EDTA將金屬離子螯合，對纖維素酶活力有一定影響，但不會被完全抑制。而纖維素酶在PMSF存在時酶活力大幅下降，抑制效果非常明顯。PMSF能專一性作用于絲氨酸，這表明我們純化纖維素酶的活性中心可能含有絲氨酸殘基。

圖5 不同酶抑制劑對纖維素酶活性的影響

2.3.5 米氏常數Km和最大反應速度Vmax

通過在不同濃度底物CMC溶液中測定纖維素酶的反應速度來確定纖維素酶的動力學常數Km和Vmax，利用雙倒數作圖法以1/[S]為橫坐標，1/V為縱坐標作圖6，利用圖6計算纖維素酶對底物CMC的

圖6 雙倒數法作圖求Km和Vmax

米氏常數Km為24.0mg/mL，最大反應速度Vmax是0.09mg/min。

3 結語

本文用單因素實驗和響應面法對黑曲霉B3菌株產纖維素酶培養條件進行了優化，確定了黑曲霉B3產纖維素酶的最優條件：小麥秸稈2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，發酵時間73.08h，接種量為8.004%，150 r/min振蕩培養，此條件下黑曲霉B3發酵液的FPA酶活力為153.4U/mL，比初始酶活力73.5U/ml提高了108%。將粗酶液初步純化后，對純化纖維素酶的酶學性質進行了初步研究，確定了其最適溫度為60℃，最適pH值為6.0；Ca2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Li+、Na+、Cu2+和K+（1.0mM）對纖維素酶酶活有一定的促進作用，而Mg2+、Ag+、Hg2+（1.0mM）則對纖維素酶有抑制作用；蛋白抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）對纖維素酶具有強烈抑制作用；利用雙倒數做圖法法計算纖維素酶對底物CMC的米氏常數為24.0mg/mL，最大反應速度為0.09mg/min。

本文通過對黑曲霉產纖維素酶條件的優化以及對纖維素酶的酶學性質進行研究，為黑曲霉纖維素酶的發酵生產提供了理論基礎，為秸稈的預處理和秸稈纖維素乙醇的生產提供了一條新的纖維素酶來源，具有一定的應用前景。

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張曈（1981—），男，山東泰安，博士，講師，主要研究方向為生物質能源。

國家自然科學青年基金（21406083）；江蘇省自然科學青年基金（BK20130416）；淮安市科技支撐計劃（HAG2011015）。