共表達pcIL-18/MAGE-1DNA疫苗對JEG-3細胞HLA-G基因表達的影響

齊亞靈　趙文杰　王偉群楊廣民時　陽方艷秋鐘南田　洪　燈　張彥慧　周　雯　符皎榮(海南醫學院，海南　海口　5799)

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共表達pcIL-18/MAGE-1DNA疫苗對JEG-3細胞HLA-G基因表達的影響

齊亞靈趙文杰王偉群1楊廣民2時陽2方艷秋2鐘南田洪燈張彥慧周雯符皎榮
(海南醫學院，海南海口571199)

〔摘要〕目的觀察共表達基因疫苗pcIL-18/MAGE-1對絨癌JEG-3細胞株HLA-G基因表達的影響，探究pcIL-18/MAGE-1抗腫瘤作用機制。方法應用構建的共表達pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗免疫小鼠，同時設陰性對照組和空白對照組，免疫后分別收集脾細胞，作用于靶細胞JEG-3，應用FCM檢測小鼠T細胞亞群情況及NK細胞活性，MTT法檢測腫瘤特異性CTL對靶細胞的殺傷率，RT-PCR法檢測HLA-G基因表達情況。結果免疫組HLA-G基因表達降低，且對JEG-3細胞殺傷活性增加，與對照組比較，差異顯著(P＜0. 05)。免疫組NK細胞活性及CD4+/CD8+、CD8+、CD4+值均高于對照組(P＜0. 05)。結論共表達基因疫苗pcIL-18/MAGE-1通過降低HLA-G基因的表達，進而增加NK細胞活性以及誘導腫瘤特異性CTL直接殺傷腫瘤細胞，發揮抗腫瘤作用。

〔關鍵詞〕MAGE-1; IL-18;絨癌; JEG-3細胞株;人類白細胞抗原-G

1佳木斯大學2吉林省人民醫院腫瘤生物治療中心

第一作者:齊亞靈(1967-)，女，教授，醫學博士，博士生導師，主要從事腫瘤基因診斷與生物治療研究。

pcIL-18-MAGE-1共表達基因疫苗接種免疫后小鼠脾細胞作為效應細胞，作用于肝癌SMMC-7721和Hepal-6細胞株，證實該疫苗通過同時激活CD4+T細胞及CD8+T細胞、增加NK細胞活性及誘導腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)直接殺傷腫瘤細胞〔1〕;體內試驗證實pcIL-18-MAGE共表達基因疫苗對荷瘤鼠具有一定抗腫瘤作用〔2〕。本文觀察pcIL-18-MAGE-1共表達基因疫苗對JEG-3細胞人類白細胞抗原(HLA)-G基因表達的影響，進一步探究pcIL-18/MAGE-1抗腫瘤作用機制。

1　材料與方法

1. 1實驗動物、細胞株、質粒清潔級雌性C57BL/6J小鼠(中國醫學科學院實驗動物研究所)，體重(20±2)g，自由食水，無菌動物室飼養。質粒pcIL-18-pcMAGE-1、pcDNA3、絨癌JEG-3細胞株(吉林省人民醫院腫瘤生物治療中心提供)。

1. 2主要試劑胎牛血清、IMDM細胞培養液、淋巴細胞分離液(PAA)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、3%氫氧化鋁(武漢博士德公司)。異硫氰酸熒光素(FITC)與PE標記的羊抗鼠CD4+、CD8+單抗、FITC標記的羊抗鼠IgG單抗、HLA-G單抗(美國Immunotech公司)，Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒(武漢陽達生物科技有限公司)，引物(上海生工生物公司)。

1. 3免疫方法及實驗分組小鼠大腿內側肌群肌肉注射:疫苗免疫組〔100 μg(0. 4 ml 3%氫氧化鋁膠)pcIL-18-pcMAGE-1〕、陰性對照組(等量pcDNA3)及空白對照組(等量0. 9%NaCl無菌水溶液)。1次/10 d，3次，末次注射7 d后，斷頭處死小鼠，將取出的脾臟浸入細胞培養液中研磨，200目濾網過濾，收集脾細胞備用。

1. 4流式細胞儀(FCM)檢測NK細胞活性及T細胞亞群每組分別取1×106個小鼠脾細胞，0. 1 mol/L PBS×2次，加入單抗10 μl，室溫避光，20 min。PBS×2次，加0. 5 ml PBS混勻，10 min后，上機檢測。

1. 5 MTT法檢測小鼠脾細胞對JEG-3細胞殺傷率將JEG-3細胞加入96孔板中，每孔4×104個細胞，貼壁后，分別加入空白對照組、陰性對照組及疫苗免疫組的4×106個效應脾細胞，每組設3個復孔。37℃、5%CO2培養箱孵育12 h;棄掉培養基及懸浮細胞，每孔加50 μl 0. 5 mg/ml MTT，37℃、5%CO2培養箱孵育4 h，棄上清，加100 μl DMSO，震蕩10 min，酶標儀在570 nm處測吸光度值(OD值)。殺傷率(%)= 1－OD(效應細胞+靶細胞)－OD效應細胞×100%。OD靶細胞

1. 6 RT-PCR技術檢測HLA-G基因表達情況將JEG-3細胞加入96孔板中(4×104個細胞/每孔)，貼壁后，將收集的陰性對照組、空白對照組及疫苗免疫組效應脾細胞(4×106個細胞/每孔)加入，同時設不加脾細胞的常規培養的JEG-3細胞為陽性對照組。37℃、5%CO2培養箱孵育24 h;棄掉培養基，分離收集JEG-3細胞，用Trizol試劑盒提取細胞總RNA、RT-PCR試劑盒進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠分析系統對擴增條帶進行密度分析，用平均灰度值代表相應基因的表達量。參照文獻〔3〕設計引物序列及反應體系，β-actin產物為619 bp，HLA-G產物為770 bp。mRNA的相對表達量=HLA-G平均灰度值/βactin平均灰度值。

1. 7統計學方法使用SPSS19. 0軟件進行t檢驗。

2　結果

2. 1 FCM檢測結果與陰性對照組和空白對照組比較，疫苗免疫組脾細胞中CD4+/CD8+比值及CD8+、CD4+細胞比例及NK細胞活性顯著增高(P＜0. 01，P＜0. 05)。陰性對照組與空白對照組差異不顯著(P＞0. 05)。見表1。

表1　各組細胞亞群和NK細胞活性比較(n=10，x ±s)

2. 2 MTT法檢測結果疫苗免疫組殺傷率(22. 1%±2. 3%)最高，與陰性對照組(14. 1%±1. 2%)和空白對照組(13. 1%± 1. 3%)差異顯著(P＜0. 05)。

2. 3 RT-PCR檢測結果瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，各組JEG-3細胞中均有HLA-G基因表達，陽性對照組、空白對照組、陰性對照組HLA-G基因表達無明顯差異，疫苗免疫組HLA-G基因表達水平明顯降低(P＜0. 05)，見圖1。

3　討論

機體內具有免疫監視作用的主要效應細胞有CTL細胞和

圖1　各組HLA-G mRNA表達RT-PCR結果

M. Marker; 1.空白對照組; 2.陽性對照組; 3.陰性對照組; 4.疫苗免疫組NK細胞，CTL細胞主要通過識別腫瘤細胞表面的MHC-I類分子，殺傷腫瘤細胞;對于不表達MHC-I類分子的腫瘤細胞，NK細胞直接殺傷。為了觀察共表達pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗對JEG-3細胞是否具有殺傷作用，我們應用構建的共表達pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗免疫小鼠，同時設陰性對照組和空白對照組，免疫后分別收集脾細胞，作用于絨癌JEG-3細胞，應用FCM檢測小鼠T細胞亞群情況及NK細胞活性，MTT法檢測腫瘤特異性CTL對靶細胞的殺傷率，結果表明，構建的pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗通過同時激活CD4+T細胞及CD8+T細胞、增加NK細胞活性以及誘導腫瘤特異性CTL直接抑制絨癌JEG-3細胞的增殖。

腫瘤細胞具有免疫逃逸功能，通過MHC-I類分子的變構和丟失或高表達HLA-G分子逃避CTL和NK細胞的殺傷作用。非經典的HLA-I類抗原——人類白細胞抗原-G(HLA-G)，是機體內重要的免疫耐受分子，HLA-G分子通過與免疫細胞上的抑制性受體:免疫球蛋白樣轉錄物2、免疫球蛋白樣轉錄物4及殺傷細胞免疫球蛋白樣受體KIR相互作用直接抑制CTL和NK細胞介導的細胞殺傷活性〔4〕;通過誘導產生多種調節性細胞及細胞因子等間接發揮免疫抑制效應〔5〕，進而導致腫瘤細胞發生免疫逃逸。HLA-G在人類乳腺癌、結腸癌、肝癌、腎癌、肺癌等組織中可表達HLA-G，并具有腫瘤特異性〔6，7〕，HLA-G在絨癌JEG-3細胞株中呈現高表達〔8〕。本文結果表明疫苗免疫后的效應細胞可以降低JEG-3細胞HLA-G基因表達。推測，共表達pcIL-18/MAGE-1 DNA疫苗對JEG-3細胞增殖抑制作用，是通過降低HLA-G基因表達，進而增加NK細胞活性及誘導腫瘤特異性CTL途徑實現的，具體信號轉導途徑有待進一步研究。

4參考文獻

1齊亞靈，孟德欣，楊廣民，等. pcIL-18-MAGE-1共表達基因疫苗對肝癌細胞株SMMC-7721、Hepal-6增殖影響〔J〕．中國老年學雜志，2014; 34(21): 6093-4.

2齊亞靈，王偉群，楊廣民，等. pcIL-18-MAGE-1基因疫苗免疫荷瘤小鼠抑瘤作用〔J〕．中國老年學雜志，2014; 34(20): 5787-8.

3 Hurks HM，Valter MM，Wilson L，et al．Uveal melanoma: no expression of HLA-G〔J〕．Invest Ophthalmol Vis Sci，2001; 42(13): 3081-4.

4李營營，許惠惠，顏衛華．HLA-G與NK細胞〔J〕．現代免疫學，2015; 35(2): 160-2，159.

5 Naji A，Menier C，Morandi F，et al．Binding of HLA-G to ITIM-bearing Iglike transcript 2 receptor suppresses B cell responses〔J〕．J Immunol，2014; 192(4): 1536-46.

6 Hansel DE，Rahman A，Wilentz RE，et al．HLA-G upregulation in pre-malignant and malignant lesions of the gastrointestinal tract〔J〕．Int J Gastrointest Cancer，2005; 35(1): 15-23.

7宋新宇，陳世雄，曾凡軍，等．非小細胞肺癌中HLA-G的表達及其與IL-10的相關性〔J〕．中國老年學雜志，2011; 31(10): 1746-7.

8王建英，李勇，程建新，等.天花粉蛋白對絨癌細胞JEG-3體外增值和HLA-G、HLA-E表達的影響〔J〕．中國老年學雜志，2008; 28(3): 247-9.

〔2014-10-19修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者:方艷秋(1968-)，女，主任醫師，醫學博士，主要從事腫瘤生物治療研究。

基金項目:海南省自然科學基金(No．310051)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5723-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 018

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R735. 7