生物蛋白膠-牙髓干細胞構建三維支架的生物相容性

胡紅梅　曾常愛　陳彩芬　李　偉(井岡山大學醫學院組胚教研室，江西　吉安　343000)

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生物蛋白膠-牙髓干細胞構建三維支架的生物相容性

胡紅梅曾常愛陳彩芬李偉1(井岡山大學醫學院組胚教研室，江西吉安343000)

〔摘要〕目的構建牙髓干細胞-生物蛋白膠支架的三維培養體系，研究牙髓干細胞在生物蛋白膠中的生物相容性。方法體外復蘇牙髓干細胞并復合進入生物蛋白膠中培養，通過CCK-8檢測提取液對細胞增長情況的影響，并通過細胞的礦化情況進一步分析生物蛋白膠的生物特性。結果凍存的牙髓干細胞經免疫熒光染色具備干細胞的特性，細胞包埋于生物蛋白膠內可見三維培養下細胞狀態更加伸展，更加模擬自然生長，細胞形態典型，2 w后生物蛋白膠可完全降解，牙髓干細胞礦化誘導結果較典型。結論生物蛋白膠是一種適宜的組織工程牙髓種子細胞載體。

〔關鍵詞〕生物蛋白膠;牙髓干細胞;生物相容性

1井岡山大學臨床醫學院口腔系

第一作者:胡紅梅(1976-)，女，碩士，副教授，主要從事干細胞的分化與增殖研究。

牙髓干細胞(DPSC)是具有克隆形成能力、高增殖率的重要成體干細胞，與支架材料構建培養可以形成牙髓牙本質復合體樣結構組織〔1〕。目前的牙髓干細胞支架材料存在細胞界面關系容易喪失、載體材料細胞丟失嚴重以及載體材料不易分解的缺點〔2〕。生物蛋白膠具有良好的生物相容性，且具有形態可控性和可注射性，作為骨髓間充質干細胞的載體，在體內已成功構建組織工程軟骨，但是將其用于牙髓組織工程研究甚少。本課題分析種子細胞DPSC與生物蛋白膠支架構建后的生物學特征，以確定適宜的組織工程牙髓種子細胞載體。

1　材料和方法

1. 1主要試劑與儀器DMEM高糖型培養基(GIBCO/HYCLONE，USA)，胎牛血清(GIBCO，USA)，胰蛋白酶、地塞米松(sigma，USA)，DMSO、L-抗壞血酸(Amesco，USA)，免疫組織化學試劑盒(DAKO，USA)，SABC試劑盒、兔抗人STRO-1單克隆抗體、抗CD34、抗CD45和抗CD146多克隆抗體(博士德試劑公司，武漢)，0. 22 μm、0. 45 μm混合纖維素濾膜(BM，德國)，生物蛋白膠(普濟醫藥技術開發有限公司，杭州)，生物安全柜(上海博訊實業有限公司)，熒光倒置顯微鏡倒置相差顯微鏡及照相系統(Olympus，Japan)，千分之一電子天平(GB303 Mettler-Toledo Instr. Ltd)，細胞培養箱(Shellab，美國)，微型高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)，高速臺式離心機(Beckman，美國)，ND-1000微量核酸定量儀(Thermo，美國)，分選型流式細胞儀(Beckman，美國)、激光共聚焦掃描顯微鏡(zeiss，德國)。

1. 2細胞復蘇前期的實驗已經培養成功并保存的牙髓干細胞復蘇后接種到細胞培養瓶中，37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱，24 h后更換一次培養液，待培養液變成黃色后再更換培養液，繼續培養。

1. 3 DPSC免疫熒光細胞化學染色鑒定取第四代的牙髓干細胞以2×104個細胞/cm2的密度種于細胞爬片上，然后在DMEM高糖型細胞培養液中37℃恒溫培養箱培養12 h，移除培養液，PBS緩沖液清洗兩次共10 min，吸干標本周圍液體，4%多聚甲醛固定15 min。按照SABC試劑盒的說明免疫組織化學染色STRO-1、CD146、CD34、CD45。在加入Ⅰ抗4℃孵育過夜后加入FITC熒光二抗(1∶40)，避光條件下孵育1 h，然后利用DAPI熒光染料對細胞核進行染色，熒光顯微鏡拍照。

1. 4 DPSC-生物蛋白膠支架的構建待取細胞培養瓶中已經長滿90%后，用0. 25%胰蛋白酶進行消化傳代，收集細胞并進行細胞計數板計數，大約5×106個第3代DPSC添加到500 μl生物蛋白膠A液(纖維蛋白原濃縮液及其溶解液)中，然后在6孔培養板中將混合有A液的細胞混懸液與生物蛋白膠B液(凝血酶及鈣離子溶液)充分混合，5%CO2培養箱培養，并在倒置顯微鏡下觀察生物蛋白膠中DPSC的生長情況及支架降解情況，待培養液變成黃色后再更換培養液，繼續培養。

1. 5 DPSC在生物蛋白膠支架中的礦化誘導將混合有生物蛋白膠的細胞培養瓶中濃度2×103/ml的DPSC接種于96孔板內，對照組僅含有普通培養基，兩組同時培養1 w后，分別進行傳代培養。以2×103/ml細胞/孔接種于24孔板，待細胞匯合至90%以上時每孔分別加入礦化誘導液(10%FBS，50 ng/ml維生素C，10 mmol/ml β-甘油磷酸鈉和2 ng/ml地塞米松)，每3 d換液，孵育4 w，4%多聚甲醛固定30 min后，茜素紅染色法鑒定礦化結節，PBS洗去多余茜素紅，再給孔內加入PBS液，鏡下觀察礦化結節的染色形成情況。

1. 6統計學分析計量資料組間比較行t檢驗。

2　結果

2. 1 DPSC免疫熒光細胞化學染色鑒定由于本次所用的細胞是前期實驗凍存在冰箱的DPSC，因此本次實驗僅作免疫熒光細胞化學染色鑒定。鑒定結果顯示DPSC抗STRO-1陽性，細胞質呈綠色的熒光染色，利用紫外光波長的光線激發DAPI染色細胞核為藍色(圖1);抗CD146染色顯示細胞質為紅色，DAPI染色細胞核為藍色，表達為陽性;通過熒光共聚焦圖片merge三維顯示，上述標志物在DPSC細胞內表達，他們在細胞內定位在細胞質，與細胞核沒有重合，表達的改變是同步的;抗CD34染色顯示細胞質無熒光染色，DAPI染色細胞核為藍色; 抗CD45染色顯示細胞質無熒光染色，DAPI染色細胞核為藍色，通過熒光共聚焦圖片merge三維顯示，上述標記物在DPSC細胞內表達陰性，僅細胞核染色(圖2)。

圖1　 CD146和STRO-1免疫熒光共聚焦圖片顯示陽性(×400)

圖2　 CD34和CD45免疫熒光共聚焦圖片顯示陰性(×400)

2. 2 DPSC在生物蛋白膠支架中生長的生物相容性檢測DPSC復合生物蛋白膠后在倒置相差顯微鏡下顯示，凝膠呈半透明狀，可見三維培養下細胞狀態更加伸展，更加模擬自然生長(圖3)，細胞狀態良好，細胞培養液消耗比對照組的培養液加快，培養液的更換頻率較對照組提前2～3 d。體外培養的成人牙髓干細胞在生物蛋白膠提取液條件下培養5 d，表明普通組與生物蛋白膠組無差別(P＜0. 05)，見圖4。

2. 3 DPSC在生物蛋白膠支架中生長的礦化能力鑒定DPSC在生物蛋白膠支架中生長2 w后，加入牙本質分化誘導液培養后，細胞的形態逐漸由長梭形變成立方狀，部分細胞形成交疊折疊呈網狀和細胞團塊狀，在連續培養2 w后，出現類似白色的小結節，行茜素紅染色，結節呈現紅色染色(圖5)，細胞結節中央顏色呈紅色，周圍較變淺。

圖3　牙髓干細胞光鏡下形態(×100)

圖4　生物蛋白膠生物相容性檢測

圖5　牙髓干細胞礦化誘導(×400)

3　討論

近年來將轉染的DPSC作為種子細胞體外加載到生物材料支架載體上在或體外培養，并種植到缺損區域以修復缺損的牙髓組織已成為了牙髓組織工程研究熱點之一〔3〕。目前的DPSC支架包括聚羥基乙酸(PGA)、左旋聚乳酸(PLLA)和羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)，在進行牙髓組織工程研究中，都存在與生物支架材料的不適應，細胞界面關系喪失導致載體材料細胞丟失嚴重，且耗時較長，形成的牙髓牙本質樣結構少且不典型結構多，載體材料不易分解的缺點〔4，5〕。生物蛋白膠含有纖維蛋白原濃縮液、凝血酶及鈣離子溶液，具有良好的生物相容性，穩定性，可降解性，并能促進細胞分化，國內外學者成功地將生物蛋白膠作為骨髓間充質干細胞的載體，在體內成功構建組織工程軟骨，為臨床提供了一種良好的組織工程支架材料。本課題組研究發現DPSC-生物蛋白膠支架中DPSC的生長相比單純培養液組更加典型，并且體外培養的成人牙髓干細胞在生物蛋白膠提取液條件下發現生物蛋白膠有很好的生物相容性，究其原因可能是由于生物蛋白膠是多空隙三維結構，能保證營養物質和代謝產物進出支架內外，通過倒置相差顯微鏡、激光共聚焦熒光顯微鏡等觀察，證實DPSC在生物蛋白膠中能夠很好地吸取營養并生長，細胞的數量更多及形態更典型，因此，我們認為生物蛋白膠是一種適宜的組織工程牙髓種子細胞載體。由于細胞與生物蛋白膠是在液態的情況下混合，并且聚合后細胞可被均勻包埋在固態的纖維蛋白網內，減少了種子細胞的丟失，而且三維網狀結構提供了較大的接觸面積和細胞生理活性面積，因此DPSC可以很好地分化〔6，7〕。

4參考文獻

1 Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al．Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，2000; 97(25): 13625-30.

2 Chung H，Yamaza T，Zhao H，et al．Stem Cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development〔J〕．Stem Cells，2009; 27(4): 866-77.

3 Kara?z E，Demircan PC，Saˇglam O，et al．Human dental pulp stem cells demonstrate better neural and epithelial stem cell properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells〔J〕．Histochem Cell Biol J，2011; 136(4): 455-73.

4王亦菁，張曉東，李里，等.三維培養的牙髓干細胞參與牙髓損傷修復能力的實驗研究〔J〕．臨床口腔醫學雜志，2011; 27(10): 582-4.

5李艷萍，梁鵬，董海波，等.人牙髓干細胞在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物支架上粘附與增殖的研究〔J〕．口腔醫學研究，2011; 27(12): 1083-6.

6張巍巍，李艷萍，潘爽，等.模擬微重力對人牙髓干細胞-PLGA復合物礦化的影響〔J〕．口腔醫學研究，2013; 29(2): 135-7.

7張萍，朱聰惠，張綱，等.人牙髓干細胞向成牙本質細胞定向分化過程中miRNAs表達譜篩選及鑒定〔J〕．實用口腔醫學雜志，2011; 27(2): 212-6.

〔2014-12-03修回〕

(編輯李相軍)

The study of biocompatibility on build three-dimensional scaffold of dental pulp stem cells with biological fibrin glue in vitro

HU Hong-Mei，ZENG Chang-Ai，CHEN Cai-Fen，et al．
Histology and Embryology Department of Medical College，Jinggangshan University，Ji'an 343000，Jiangxi，China

【Abstract】Objective To build the three-dimensional cultivation system of dental pulp stem cells with biological fibrin glue bracket，study the compatibility of dental pulp stem cells in biological fibrin glue，explore the feasibility of the biological fibrin glue in the dental pulp tissue engineering scaffold．Methods The dental pulp stem cells were recovered in vitro and identificated by immunofluorescence staining，and cultivated in biological fibrin glue，the effect of cell growth was detected by CCK 8，the characteristics of the biological fibrin glue was analyzed through mineralization changes of the cells．Results Dental pulp stem cells in frozen storage had the characteristics of stem cells by immunofluorescence staining，cell state was more stretch，more simulated natural growth and more the typical forms in embedding in biological fibrin glue，the biological fibrin glue had completely degradations after 2 weeks，induced mineralization results of dental pulp stem cells．Conclusions Biological fibrin glue is a suitable carrier of dental pulp tissue engineering seed cells．

【Key words】Biological fibrin glue; Dental pulp stem cells; Compatibility

通訊作者:李偉(1972-)，男，碩士，副教授，主要從事牙體牙髓疾病的病因及治療研究。

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81341109)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5712-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 013

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R781