活性維生素D對糖尿病腎病大鼠足細胞損傷的抑制效果及其可能機制

王世英　時　軍　陳寶平　(河南大學淮河醫院，河南　開封　475000)

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活性維生素D對糖尿病腎病大鼠足細胞損傷的抑制效果及其可能機制

王世英時軍陳寶平(河南大學淮河醫院，河南開封475000)

〔摘要〕目的探討活性維生素D對糖尿病腎病(DN)大鼠足細胞損傷的抑制效果及其可能機制。方法將48只Wistar雄性大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、正常大鼠給予活性維生素D干預組(VD組)、DN模型組(DN組)、給予活性維生素D干預的DN模型組(DN+VD組)，每組10只。定期收集血、尿標本，18 w末處死，檢測尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、尿蛋白水平;分別采用過碘酸雪夫(PAS)、Mssson染色觀察腎組織病理改變，電鏡下觀察足細胞改變。免疫組化檢測腎組織VDR和相關蛋白表達情況。Western印跡分析相關蛋白表達與PI3K/p-Akt信號通路的關系。結果造模后6～18 w，與NC組、VD組相比，DN組尿蛋白量明顯上升(P＜0. 05)，在給予VD干預后18 w結束時約降低37%。造模18 w后，DN組腎質量體質量比明顯高于NC組和VD組(P＜0. 05)，給予VD干預后明顯下降。DN組、DN+VD組血BUN水平明顯高于NC組和VD組(P＜0. 05)。NC組和VD組高表達Podocin和Nephrin，DN組大鼠以上兩種蛋白表達明顯減少; NC組大鼠低表達Desmin，DN組大鼠表達明顯增加。給予VD干預后Podocin和Nephrin表達均明顯高于DN組，但仍明顯低于NC組和VD組; Desmin表達明顯低于DN組。DN組大鼠VDR表達水平明顯低于NC組和VD組，給予VD干預后表達水平明顯上升。DN組大鼠腎組織PI3K-p85表白水平明顯低于NC組和VD組，給予VD干預后表達水平明顯上升。四組間總Akt水平無明顯差異，但DN組p-Akt水平表達明顯降低，經VD干預后明顯上升。相關性分析顯示，Nephrin與VDR、PI3K-p85、p-Akt之間均呈明顯的正相關。結論活性維生素D可有效抑制鏈脲佐菌素(STZ)誘導的DN大鼠足細胞損傷，其機制可能與影響PI3K/p-Akt信號通路有關。

〔關鍵詞〕糖尿病腎病;活性維生素D;足細胞;機制

糖尿病腎病(DN)病情發展中足細胞損傷是一個重要環節，但其機制目前仍未完全明確。足細胞中存在特殊的足突結構，且足突彼此相連也依賴于裂孔膈膜蛋白。研究顯示足細胞裂孔膈膜蛋白Podocin、Nephrin等表達異常為足細胞早期損傷的一個特異性標志，同時Nephrin還是重要的信號蛋白〔1〕。有研究顯示，在某些疾病狀態下，通過穩定PI3K/p-Akt信號通路能夠有效緩解足細胞受損，降低蛋白尿發生率〔2〕。本文旨在研究活性維生素D對DN大鼠足細胞損傷的抑制作用，并探討活性維生素D是否通過穩定PI3K/p-Akt信號通路來抑制足細胞損傷。

1　材料與方法

1. 1材料健康清潔級Wistar雄性大鼠40只，質量170～190 g，購于上海斯萊克實驗動物技術有限責任公司，動物合格證號: SCXK(滬): 2007-0005。活性維生素D3(上海羅氏制藥有限公司，國藥準字J20100056)。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，血糖檢測儀(德國羅氏)，兔抗大鼠VDR及Podocin多克隆抗體(美國Bioss公司)，兔抗大鼠Nephrin、Desmin、PI3K-p85、Akt、p-Akt多克隆抗體(美國Immunoway公司)，免疫組化試劑盒(上海金標生物科技有限公司)。

1. 2研究方法

1. 2. 1模型建立與分組大鼠適應性喂養1 w后，禁食自由飲食12 h，隨機分為正常對照組(NC組)、正常大鼠給予活性維生素D干預組(VD組)、DN模型組(DN組)、給予活性維生素D干預的DN模型組(DN+VD組)，每組10只。DN組大鼠給予60 mg/kg STZ一次性腹腔注射建模，3 d后檢測血糖水平＞16. 7 mmol/L說明造模成功; NC組給予等量生理鹽水腹腔注射。造模成功后第2天，VD組給予花生油為溶劑的骨化三醇溶液0. 1 μg·kd－1·d－1灌胃，其余兩組給予等量花生油灌胃。

1. 2. 2樣本收集與檢測模型建立后每2 w檢測1次大鼠體質量和血糖水平，每3 w收集24 h尿液。在第18周結束時處死大鼠，留取血液樣本和腎組織標本。采用全自動生化分析儀檢測血鈣(Ca)、血磷(P)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平，采用馬斯亮藍法測定24 h尿蛋白量水平。

1. 2. 3腎臟組織病理學檢查腎臟組織采用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后進行切片和過碘酸雪夫(PAS)染色、Mssson染色，在光學顯微鏡下觀察病理學改變。采用Image-Pro6. 0軟件計算腎小球面積和系膜基質增生面積。每張切片均隨機取30個聯系不重復的腎小球，進行腎臟損傷評分。經3. 0%戊二醛固定、制片，在電鏡下觀察腎小球足突和基底膜的變化。

1. 2. 4免疫組織化學將石蠟切片脫蠟水化，微波對抗原進行修復，免疫組化染色(SP)法使用免疫組化試劑盒檢測VDR、Podocin、Nephrin、Desmin的表達。操作嚴格按照說明書進行。每張切片均隨機取30個不同的腎小球視野，進行半定量分析:無色(－)、淡黃色(+)、棕黃色()、棕褐色()。依據免疫組化反應評價標準進行評分。

1. 2. 5 Western印跡分析取適量液氮凍存的腎皮質，加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶的裂解液，超聲破碎后在4℃條件下2 000 r/min離心30 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。取等量的組織蛋白，90℃溫度下變性5 min，10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳后按濕轉法將產物轉印到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，使用含10%的脫脂牛奶室溫條件下封閉60 min，之后采用0. 5%Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，分別于本次研究中選用的抗體在4℃條件下孵育過夜，洗膜后加入標記的二抗在室溫條件下孵育60 min，洗膜后采用增加化學發光法(ECL)處理后用凝膠定量分析系統測量蛋白條帶吸光度。以β-actin為內參，檢測蛋白的相對表達水平。

1. 3統計學方法應用SPSS18. 0軟件進行方差分析和Pearson分析。

2　結果

2. 1大鼠血、尿指標變化情況造模后6～18 w，與NC組、VD組相比，DN組尿蛋白量明顯上升(P＜0. 05)，在給予VD干預后明顯下降，18 w結束時約降低37%，但仍明顯高于NC組(P＜0. 05)。造模18 w后，DN組腎質量體質量比明顯高于NC組和VD組(P＜0. 05)，在給予VD干預后明顯下降，但仍高于NC組和VD組。NC組與VD組之間血BUN水平差異無統計學意義(P＞0. 05); DN組、DN+VD組血BUN水平明顯高于NC組和VD組(P＜0. 05)。血鈣、血磷、血Scr等指標四組間差異無統計學意義(P＞0. 05)。

2. 2大鼠腎組織病理學改變PAS染色顯示，DN組大鼠腎小球肥大伴系膜基質明顯增生，在給予VD干預后病變情況明顯減輕。Masson染色顯示，四組大鼠腎組織慢性化損傷指標之間無明顯差異。電鏡觀察顯示，DN組大鼠腎小球足突出現融合，基底膜厚度增加，DN+VD組以上病變明顯減輕。見圖1。

圖1　四組大鼠腎組織病理學改變

PAS、Masson染色(×400); EM(×10 000)

2. 3大鼠腎組織足細胞Podocin、Nephrin、Desmin表達情況SP法顯示，NC組和VD組高表達Podocin和Nephrin，DN組大鼠以上兩種蛋白表達明顯減少; NC組大鼠低表達Desmin，DN組大鼠表達明顯增加。免疫組化半定量和Western印跡分析顯示，給予VD干預后Podocin和Nephrin表達均明顯高于DN組，但仍明顯低于NC組和VD組; Desmin表達明顯低于DN組。見圖2。

圖2　四組大鼠腎組織足細胞Podocin、Nephrin、Desmin表達

2. 4大鼠腎組織中VDR表達情況NC組大鼠腎組織中VDR主要在足細胞表達，DN組大鼠VDR表達水平明顯低于NC組和VD組，給予VD干預后表達水平明顯上升。見圖3。

圖3　四組大鼠腎組織中VDR表達

2. 5維生素D對大鼠腎組織PI3K/p-Akt信號通路影響DN組大鼠腎組織PI3K-p85表白水平明顯低于NC組和VD組，給予VD干預后表達水平明顯上升。四組間總Akt水平無明顯差異，但DN組p-Akt水平表達明顯降低，經VD干預后明顯上升。見圖4。

圖4　四組大鼠腎組織PI3K-p85、Akt、p-Akt表達

2. 6 Nephrin與VDR、PI3K、p-Akt相關性分析Pearson分析顯示，Nephrin與VDR、PI3K-p85、p-Akt之間均呈明顯的正相關(r=0. 787、0. 747、0. 866，P=0. 029、0. 031、0. 016)。

3　討論

目前研究顯示，活性維生素D除具有調節體內鈣、磷離子和骨代謝之外，還對內分泌、神經、生殖、免疫等多方面發揮著重要的生理功能，其可有效降低慢性腎臟疾病患者的尿蛋白水平〔3〕。在2型糖尿病患者中活性維生素D缺乏為治療預后的獨立危險因素，相關動物研究也顯示，維生素D干預后可明顯降低尿蛋白水平，減少足細胞損失〔4〕。但目前為止維生素D對腎臟的上述保護作用的機制仍未明確。

有研究顯示，腎小球足細胞受損為DN早期主要的分子病理學特征，其中足細胞損失相關蛋白Podocin、Nephrin的非正常表達為特征性標志〔5〕。本研究說明DN大鼠存在明顯的足細胞損傷。另外維生素D可有效抑制DN大鼠的足細胞損傷，但相關作用機制仍需要進一步研究。本次研究中活性維生素D未對DN大鼠血Scr、BUN產生明顯影響，其可能與Scr、BUN的改變受多因素影響有關。

Nephrin為一種有信號蛋白和結構蛋白功能的腎組織足細胞特異分子，其異常表達會在一些病理狀態下隨著足細胞表型和蛋白尿的改變而變化〔6〕。本研究進一步證實了DN早期腎組織足細胞損傷中存在明顯的PI3K/p-Akt信號通路下調，而活性維生素D對足細胞受損的抑制效果可能與上調該通路有關。

活性維生素D常通過與VDR結合發揮作用。機體中存在細胞核的細胞均能夠表達VDR，其中在肺、結腸等部位的淋巴細胞和細胞中表達量較高，足細胞同樣也能夠表達VDR〔7〕。本研究說明活性維生素D減輕足細胞受損可能與上調VDR的表達有關。

4參考文獻

1 Stitt-Cavanagh E，MacLeod L，Kennedy C. The podocyte in diabetic kidney disease〔J〕．Scientific World J，2009; 31(9): 1127-39.

2魏凱，李肖瑛，倪兆慧，等.激活環磷酸腺苷/蛋白激酶信號對藥物誘導足細胞損傷的影響〔J〕．中華腎臟病雜志，2013; 29(10): 754-60.

3高慧，王向托，楊立志，等.維生素D與慢性腎臟疾病〔J〕．中國老年學雜志，2013; 33(7): 1710-2.

4鄒敏書，余健，聶國明，等.活性維生素D對腎病大鼠的腎臟保護作用〔J〕．解放軍藥學學報，2010; 26(2): 95-8，封3.

5朱瑋瑋，陳惠萍，葛永純，等.糖尿病腎病腎小球濾過膜結構與腎功能及代謝指標的關系〔J〕．腎臟病與透析腎移植雜志，2010; 19(1): 30-5.

6王鋒，范亞平，達展云，等.低蛋白合并α-酮酸飲食對被動型Heymann腎炎大鼠腎小球足細胞Nephrin表達的影響〔J〕．山東醫藥，2012; 52(1): 31-3.

7鄭敏.維生素D及維生素D受體的研究進展〔J〕．醫學綜述，2013; 19(21): 3965-7.

〔2015-02-17修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:陳寶平(1958-)，男，主任醫師，主要從事腎病研究。

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5700-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 009

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R587. 2

第一作者:王世英(1980-)，女，主治醫師，主要從事腎病研究。