主動(dòng)脈中膜鈣化型動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立

龔博君　李自成　(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東　廣州　510632)

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主動(dòng)脈中膜鈣化型動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立

龔博君李自成(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州510632)

〔摘要〕目的探討SD大鼠在維生素D3聯(lián)合高脂飼料處理下，90 d建立動(dòng)脈粥樣硬化(AS)模型的可行性。方法雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分成:對(duì)照組和AS組。對(duì)照組予以基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，AS組維生素D3以60萬U/kg實(shí)驗(yàn)開始前4 d連續(xù)腹腔注射，之后以30萬U·kg-1·30 d-1的劑量腹腔注射，并聯(lián)合高脂飼料飼養(yǎng)90 d。檢測(cè)0、45及90 d血清總膽固醇(TC)、鈣離子和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度。HE染色法檢測(cè)AS過程中主動(dòng)脈動(dòng)態(tài)病理變化。結(jié)果90 d AS組TC、動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)及鈣離子濃度顯著高于0 d和90 d對(duì)照組(均P＜0. 05)，90 d時(shí)出現(xiàn)主動(dòng)脈中膜鈣化型AS斑塊。結(jié)論SD大鼠在維生素D3聯(lián)合高脂飼料處理下，90 d成功構(gòu)建了主動(dòng)脈中膜鈣化型AS模型。

〔關(guān)鍵詞〕動(dòng)脈粥樣硬化;維生素D3;動(dòng)物模型

冠心病是發(fā)達(dá)國家死亡的主因，其在國內(nèi)外的發(fā)病規(guī)律存在著年齡、種族、地域及性別的差異。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是冠心病的基礎(chǔ)病理變化，與多危險(xiǎn)因素〔1〕關(guān)系密切，如高脂血癥、高血壓及糖尿病等。早期研究發(fā)現(xiàn)多種動(dòng)物在相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件誘導(dǎo)下可形成AS動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。盡管目前有關(guān)AS機(jī)制的研究較多，但基于其發(fā)病原因的復(fù)雜性，具體機(jī)制尚未明確。本研究旨在通過應(yīng)用高脂飼料誘導(dǎo)高脂血癥發(fā)生，進(jìn)一步應(yīng)用大劑量維生素D3改變動(dòng)物體內(nèi)鈣離子濃度，通過高脂血癥聯(lián)合鈣超載方式建立主動(dòng)脈中膜鈣化型AS模型。

1　材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重160～200 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中。隨機(jī)分成2組，對(duì)照組及AS組，每組30只。在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組第0天、45天及90天分別處死10只大鼠，AS組第0天、45天及90天分別處死10只、10只及8只大鼠。

1. 2高脂飼料配方膽固醇4%，膽酸鈉0. 5%，豬油10%，白糖5%，丙硫氧嘧啶0. 2%，基礎(chǔ)飼料80. 3%。購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK(粵)2008-0002。

1. 3維生素D3注射液產(chǎn)自上海通用醫(yī)藥有限公司，購自廣州，批準(zhǔn)文號(hào): H31021404。

1. 4造模方式AS組實(shí)驗(yàn)開始前4 d予以維生素D3 60萬U·kg-1·d-1腹腔注射，之后每30天以30萬U·kg-1腹腔注射，并給予高脂飼料飼養(yǎng);對(duì)照組予以普通飼料飼養(yǎng)。

1. 5指標(biāo)檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)開始、每30 d及每45 d稱量各組動(dòng)物體重。實(shí)驗(yàn)開始前、第45天及第90天將動(dòng)物隔夜禁食，并于次日清晨8點(diǎn)兩組各隨機(jī)抽取10只，10%水合氯醛麻醉后，用抗凝或不抗凝生化管腹主動(dòng)脈采血，離心，于采血當(dāng)日進(jìn)行血清總膽固醇(TC)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及鈣離子濃度檢測(cè)，以上3種成分的檢測(cè)方法分別為酶耦聯(lián)比色法、沉淀分離法和酶聯(lián)免疫法。并計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)。

1. 6腹主動(dòng)脈HE染色采血結(jié)束后用4%甲醛充分行心臟灌洗，根據(jù)動(dòng)物解剖結(jié)構(gòu)分離主動(dòng)脈從升主動(dòng)脈起直至降主動(dòng)脈末，將主動(dòng)脈縱向剖開，分離脂肪組織，將主動(dòng)脈浸泡于4%甲醛中，固定時(shí)間控制在約24 h內(nèi)，之后以濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，包埋后切片，并行HE染色。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17. 0軟件行方差分析。

2　結(jié)果

2. 1一般情況AS形成過程中AS組與對(duì)照組大鼠比較，AS組大鼠毛色晦暗，出現(xiàn)尿量增多，反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，全過程體重?zé)o明顯增加。AS模型建模成功率80%(8/10)。

2. 2血清學(xué)指標(biāo)在各組間的比較AS組45 d和AS組90 d 的TC及鈣離子水平與AS組0 d比較，差異顯著(均P＜0. 05)，AS組90 d TC及鈣離子水平與AS組45 d及對(duì)照組90 d間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0. 05)，見表1。

2. 3體重和AI在各組間的比較體重在對(duì)照組0 d、45 d及90 d間的比較差異顯著(均P＜0. 05)。AIAS組45 d、AS組90 d 與AS組0 d比較差異顯著(均P＜0. 05)，見表2。

2. 4 HE染色對(duì)照組0 d，45 d及90 d主動(dòng)脈HE染色均未見病理改變。AS組SD大鼠主動(dòng)脈病理學(xué)HE染色動(dòng)態(tài)改變結(jié)果如下所示: 0 d AS組結(jié)果為主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜、中膜及外膜清晰可見，中膜可見梭型平滑肌細(xì)胞，無病理學(xué)改變。45 d AS組結(jié)果為主動(dòng)脈部分內(nèi)膜部分區(qū)域稍有破損，中膜可見散在分布鈣化灶存在，非鈣化區(qū)且平滑肌細(xì)胞排列紊亂，鈣化區(qū)域無法找到平滑肌細(xì)胞。90 d AS組結(jié)果中膜可見大量鈣化灶及斑塊，無法找到平滑肌細(xì)胞，見圖1。

表1　一般生化學(xué)指標(biāo)的比較(x±s，mmol/L，n=10)

表2　 AS形成過程中體重和AI的比較(x ±s，n=10)

圖1 AS組主動(dòng)脈病理變化( HE)

3　討論

繼1908年國外學(xué)者采用蛋和奶飼養(yǎng)出兔AS模型后，國內(nèi)外多數(shù)研究者以AS成機(jī)制為研究突破口，探討并研究出較多的AS動(dòng)物模型:①以兔〔2，3〕為研究對(duì)象，基礎(chǔ)飼料并低濃度膽固醇混合高脂飼料飼養(yǎng)法，1913年第一次成功建立兔AS模型，以兔為模型的研究雖較常用，但飼養(yǎng)費(fèi)用較高;②也有學(xué)者用狒狒〔4〕、猴、狗和豬等在高脂飼料飼養(yǎng)基礎(chǔ)上歷經(jīng)長(zhǎng)達(dá)約12個(gè)月建立AS模型，盡管此模型斑塊形成過程與人類斑塊過程極為類似，但耗力、耗時(shí)、耗財(cái)，且相關(guān)動(dòng)物不易獲取，應(yīng)用以上動(dòng)物造模以國外多見;③國內(nèi)外學(xué)者還將apoE-/-小鼠〔5〕、SHR大鼠及轉(zhuǎn)基因兔等動(dòng)物應(yīng)用免疫損傷〔6〕、主動(dòng)脈球囊損傷并高脂飼料等方法建模，自從1992年兩項(xiàng)有關(guān)apoE基因敲除小鼠的重要研究在《Science》及《Cell》雜志發(fā)表后，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建立AS模型愈來愈受到歡迎，此種動(dòng)物不僅抗AS作用弱，干擾小，其造模結(jié)果與人類AS病變過程極為類似，且造模成功率高，成模周期短，但費(fèi)用高，采血量少，以組織研究多見?？傊?，采用apoE基因敲除小鼠造AS模型仍然引領(lǐng)著主流方向。

在應(yīng)用非基因敲除鼠類建立AS模型過程中，國內(nèi)外研究主要以維生素D3或維生素D2合并不同濃度膽固醇高脂飼料飼養(yǎng)方法建模: 2000年，Bennani-Kabchi等〔7〕采用了維生素D2聯(lián)合低濃度膽固醇灌胃并基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，90 d造模成功，這是國際上首次用沙鼠造出的AS模型，且在主動(dòng)脈病變區(qū)域找到了纖維帽、脂質(zhì)核心及鈣化灶。2008年，Aubin等〔8〕用單純高脂飼料飼養(yǎng)8 w，僅出現(xiàn)高脂血癥模型。2010年，Pang等〔9〕用維生素D3以70萬U·kg－1·d－1連續(xù)4 d腹腔注射并4%膽固醇的高脂乳劑灌胃加基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，3個(gè)月建立SD大鼠AS模型。此外，也有研究者采用雄性SD大鼠聯(lián)合維生素D3肌注并高脂飼料飼養(yǎng)建模。本研究為降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，方便實(shí)驗(yàn)操作，采用4%膽固醇高脂飼料并維生素D3腹腔注射的方法建立SD大鼠AS模型。

維生素D3聯(lián)合高脂飼料為何能建立主動(dòng)脈中膜鈣化性AS模型?一方面: Ca2+是機(jī)體內(nèi)重要的第二信使，既往報(bào)道血管壁脂質(zhì)條紋、纖維斑塊及晚期復(fù)合斑塊內(nèi)鈣含量分別為健康血管鈣濃度的13倍、24倍及80倍。當(dāng)無活性的維生素D3進(jìn)入腸道后，可促進(jìn)腸道對(duì)鈣離子吸收，促使機(jī)體內(nèi)無論是血漿中還是細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平上升，從而可能通過“鈣超載”與氧化應(yīng)激共同作用的機(jī)制促進(jìn)鈣化型AS斑塊形成，但有關(guān)鈣超載與AS的具體機(jī)制仍有待探究;另一方面: Cardús等〔10〕考慮與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子作用下所至的血管平滑肌細(xì)胞增生有關(guān);此外，以AS的形成機(jī)制為出發(fā)點(diǎn)，高脂飼料飼養(yǎng)影響了體內(nèi)脂類代謝，形成高脂血癥狀態(tài)，因此在高脂血癥與高鈣血癥的協(xié)同作用下，更有利于AS形成。

本研究90 d時(shí)HE染色可見主動(dòng)脈大量鈣化灶及斑塊灶形成，且Ca2+平均濃度在整個(gè)AS過程中維持較高水平。AI作為國際上衡量AS嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，當(dāng)AI＞4時(shí)，說明體內(nèi)已有粥樣斑塊形成。本研究中AS組45 d與90 d時(shí)，AI均值水平均高于5，主動(dòng)脈HE染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)90 d成功建立了主動(dòng)脈中膜鈣化型AS模型。此種AS在老年患者中最為常見。本研究為未來老年AS患者鈣化型AS提供了較好的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

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〔2014-07-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

通訊作者:李自成(1962-)，男，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事冠心病的基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目:廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 20101096136);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2010Y1-C941);暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科基金(No. 2010-4)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5687-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 004

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R965. 1

第一作者:龔博君(1987-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)研究。