急性主動脈夾層患者主動脈組織和血漿中微小核糖核酸的差異表達*

王曉建 ，黃畢，樊曉寒，蘇文君，張良，路天怡，田力，楊艷敏，惠汝太，張澍

急性主動脈夾層患者主動脈組織和血漿中微小核糖核酸的差異表達*

王曉建 ，黃畢，樊曉寒，蘇文君，張良，路天怡，田力，楊艷敏，惠汝太，張澍

目的：本研究旨在尋找新的可作為急性主動脈夾層（AAD）診斷標志物的微小核糖核酸(miRNAs)。

方法：入選4例A型AAD患者的升主動脈病變組織標本（AAD1組）和4例無心血管疾病的器官捐贈者的升主動脈組織標本（NC1組）；入選20例A型AAD患者（AAD2組）和20例無心血管疾病正常對照者（NC2組）并分別采集血漿，兩組病例對照的年齡、性別嚴格匹配。利用miRNA芯片技術，檢測四組受試者的升主動脈組織和血漿miRNAs表達譜，整合兩組分析結果，確定AAD患者組織和血漿均差異表達的miRNAs。

結果：主動脈組織miRNA芯片結果顯示，AAD患者中30個miRNAs表達顯著改變，其中13個表達上調，17個表達下調。血漿miRNA芯片分析顯示，AAD患者有93個miRNA差異表達，其中33個表達上調，60個表達下調。整合兩個表達譜，共有4個miRNAs（miR-4313、-933、-1281和-1238）在血漿和組織均顯著升高。其中，AAD1組較NC1組、AAD2組較NC2組miR-4313分別上調1.5倍和42.4倍， miR-933分別上調10.4倍和26.8倍，miR-1281分別上調1.7倍和17.8倍，miR-1238分別上調1.3倍和13.8倍。

結論：通過miRNA芯片分析，我們篩選到4個在AAD患者主動脈組織和血漿中均升高的miRNAs。這些miRNA可能是診斷AAD的生物標志物，但需大樣本驗證。

miRNA芯片；急性主動脈夾層；miRNA差異表達

Methods: Our work included 2 sets of groups.①AAD 1 tissue group, containing the aortic tissue of A type AAD patients and Control 1 group, containing the aortic tissue of the subjects without cardiovascular disease. n=4 in each group.②AAD 2 plasma group, containing the plasma of A type AAD patients and Control 2 group, containing the plasma of the subjects without cardiovascular disease. n=20 in each group. The age and gender were strictly matched between the patients and control subjects. The miRNAs expression in ascending aortic tissue and plasma were examined by microarray analysis in 4 groups, and the results in 2 sets of groups were integrated to identify the differential expression of miRNAs in AAD patients.

Results: The microarray analysis indicated that in AAD patients, the aortic tissue had 30 differentially expressed

miRNAs, 13 of them were up-regulated and 17 were down-regulated; plasma had 93 differentially expressed miRNAs, 33 of them were up-regulated and 60 were down-regulated. With integrated analysis, 4 miRNAs expressions were increased in both aortic tissue and plasma as miR-4313, miR-933, miR-1281 and miR-1238. Compared with Control 1 group and Control 2 group, AAD 1 group and AAD 2 group showed up-regulated miR-4313 at 1.5-fold and 42.4-fold, up-regulated miR-933 at 10.4-fold and 26.8-fold, up-regulated miR-1281 at 1.7-fold and 17.8-fold, up-regulated miR-1238 at 1.3-fold and 13.8-fold respectively.

Conclusion: There were 4 differentially expressed miRNAs in both aortic tissue and plasma in AAD patients, which might be the potential biomarkers of AAD, while large sample investigation is needed.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:154.)

急性主動脈夾層（AAD）是心血管疾病的危急重癥，具有發病突然、進展迅速、死亡率高的特點。由于缺乏特異的臨床表型，AAD初診誤診率往往超過25%，甚至達到50%[1-6]。診斷延誤與預后密切相關，未及時診治的主動脈夾層患者3天和2周死亡率分別高達50%和80%[7,8]。因此，提高主動脈夾層診斷水平是改善患者預后的關鍵。血漿生物標志物具有操作便捷、價格便宜等特點，在主動脈夾層診斷中被日益重視。D-二聚體、平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）、腦型肌酸激酶（CK-BB）、Calponin是已發現的AAD血漿標志物[9-12]。這些因子在AAD患者血漿中顯著升高，具有一定的指示意義，但由于敏感性或特異性不高，尚不能成為診斷AAD理想的生物標志物。微小核糖核酸（miRNAs）是一類長約21～23個堿基的單鏈非編碼小分子RNA，與疾病密切相關并在血漿中穩定存在[13,14]。目前已有多個miRNA被證實為心血管疾病的分子標示物，但miRNA與AAD的研究較少。本研究擬通過分析AAD患者和正常對照者主動脈組織和外周血miRNA的表達差異，篩選可能作為AAD診斷的生物標志物，為AAD的診治提供新思路和新策略。

1 資料與方法

主動脈組織樣本的選取及采集：2011-01至2011-05期間，采集我院4例A型AAD患者（AAD1組）的升主動脈病變組織標本。患者均為男性，平均年齡（49.1±4.9）歲。AAD患者均經過計算機斷層掃描攝影術（CT）確診，并排除馬凡綜合征、Loeys-Dietz綜合征及家族性主動脈夾層瘤?；颊邚陌l病至手術時間不超過24小時。術中取出典型病變組織標本，立即分為1 cm3的小塊，置于冰浴的無RNA酶凍存管中，液氮速凍，即刻轉移至-80℃冰箱中保存備用。正常對照的組織標本來自4例無心血管疾病的器官捐贈者（NC1組），均為男性，平均年齡（47.9±6.7）歲。升主動脈組織標本的采集和保存方法同前。

血漿樣本的選取及采集：2011-01至2011-09，選取我院入選急性A型AAD患者20例（AAD2組），平均年齡（53.3±13.5）歲，男性14例（70%）；同時選取超聲心動圖和心電圖檢查確認無心血管病疾病者20例（NC2組）作為對照，男性14例（70%），平均年齡（51.9±11.2）歲。AAD患者診斷排除標準同前，且從發病至采血不超過24小時。采集兩組受試者的4 ml靜脈血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，4℃低溫離心機離心（2 000 g，10分鐘），分離血漿，-80℃儲存備用。本項目全部研究內容均獲得阜外心血管病醫院倫理委員會同意，所有受試者均簽署知情同意書。

總RNA提取及質檢：①組織樣本：使用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit (AM1560, Ambion, Austin, TX, USA)提取總RNA。抽提所得總RNA經Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) 檢測濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。AAD1組4例患者樣本和NC1組4例正常對照樣本的總RNA的OD260/OD280均在2.0～2.1之間，28 s和18 s條帶清晰，且28 s/18 s＞2。 ② 血漿樣本：從AAD2組和NC2組每個受試者的血漿中取10 μl，將各組的20位受試者血漿分別混合。使用mirVanaTMPARISTMKit(AM1556, Ambion, Austin, TX, USA) 提取血漿總RNA。Agilent Bioanalyzer 2100檢測濃度和純度。兩組的總RNA的OD260/OD280均在1.9～2.1之間。

芯片實驗：① 組織樣本：采用Agilent human miRNA （8×60 K） V16.0芯片 （Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）檢測AAD1組和CN1組組織樣本miRNA表達譜，樣本經熒光標記后，在滾動雜交爐中與芯片雜交，采用Agilent Microarray Scanner掃描芯片結果，用Feature Extraction software 10.7讀取數據，采用Gene Spring Software 11.0進行歸一化處理。②血漿樣本：采用Agilent human miRNA（8×60 K）V19.0芯片檢測AAD2組和NC2組血漿樣本分別混合后miRNA表達譜。所有操作同前。組織和血漿樣本的miRNA芯片實驗由上海伯豪生物技術有限公司完成。

統計學分析：數據分析包括芯片數據的統計學分析、差異表達miRNA靶基因分析。以對照組主動脈組織樣本中各miRNA表達量的數學均數為正常值，主動脈夾層患者組織樣本分別與之比較。差異表達的miRNAs的篩選標準為：表達倍數變化量（foldchange）≥1.3倍（上調）或≤0.27倍（下調），且P＜0.05。

2 結果

四組受試者的基線資料比較：AAD1組與NC1組、AAD2組與NC2組的年齡、性別完全匹配，差異無統計學意義（P＞0.05)。AA2組較NC2組的高血壓患者比例高，差異有統計學意義（P＜0.05)，四組的動脈粥樣硬化患者比例差異無統計學意義（P＞0.05)。表1

表1 四組受試者的基線資料比較 [例（%）]

AAD1組與NC1組主動脈組織miRNA差異表達的結果：30個miRNAs在AAD1組中差異表達（圖1），13個miRNAs表達上調，17個miRNAs表達下調。miRNAs差異表達量增加或降低數倍至數百倍不等，上調量最大的miRNA是has-miR-31，較NC1組表達增加496倍，下調最大的miRNA是has-miR-936，較NC1組下調超過300（1/0.003）倍。表2

圖1 AAD1組與NC1組的主動脈組織差異表達miRNA的火山圖

表2 AAD1組與NC1組主動脈夾層組織中miRNA差異表達的miRNAs

AAD2組與NC2組血漿miRNA表達的結果: 93個miRNAs在AAD2組中差異表達，33個表達上調，60個表達下調。表達差異最顯著的有20個miRNAs（表3）。上調最顯著的是has-miR-4313，AAD2較NC2組增加42.2倍；下調最顯著的是hasmiR-4454，AAD2組僅為NC2組的1/100。

表3 AAD2組與NC2組患者血漿中miRNA差異表達最顯著的20個miRNAs

AAD1組組織差異表達miRNA與AAD2組血漿差異表達miRNA整合分析結果：共發現了4個在組織和血漿中均差異表達的miRNAs，分別是hasmiR-4313、has-miR-933、has-miR-1281和hasmiR-1238（表4）。這4個miRNAs在AAD1組合AAD2組的組織和血漿中均表達上調，其中上調量較高的是has-miR-4313和has-miR-933。AAD1組較NC1組、AAD2組較NC2組has-miR-4313分別上調1.5倍和42.4倍，has-miR-933分別上調10.4倍和26.8倍。

表4 AAD1組和AAD2組差異表達的miRNAs整合分析結果

3 討論

本研究利用miRNA芯片分析了四組受試者的主動脈組織和血漿中miRNA表達曾找到了四個在組織和血漿中均差異表達的miRNAs。這四個miRNA既與主動脈夾層的病變密切相關，亦在外周血顯著升高，很可能成為新的AAD診斷生物標志物。

近年來，多項研究表明miRNAs在血管性疾病的發生、發展中發揮重要的作用。全身敲除miRNAs成熟所必須的Dicer酶，小鼠在胚胎期即出現血管生成障礙[15]，血管平滑肌特異性敲除Dicer基因，小鼠會出現腹腔出血和胚胎期死亡[16]。因此，miRNAs在血管發育過程中起重要調節作用。此外，miRNAs已被證實參與血管平滑肌細胞從收縮型向合成型的表型轉化。過表達miR-143和mir-145可促進血管平滑肌細胞收縮表型的形成，而抑制miR-143和miR-145促進合成型表型的形成[17，18]。Leeper等[19]發現，過表達miR-21后可抑制腹主動脈瘤的進展，相反，抑制miR-21可促進腹主動脈瘤的進展[20]。

miRNAs在病灶部位的表達與疾病進程密切相關，由于其在血漿中穩定存，病灶部位的miRNA表達改變會直接反應到外周血miRNA水平，進而可作為診斷疾病、判斷治療反應或預測預后的血清標志物[21-25]。多個miRNAs已被證實對心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭及心律失常等的診斷具有重要價值[14,26]，但miRNAs在主動脈疾病方面的研究還很少。Liao等[27]對6例主動脈夾層患者和6例正常對照通過芯片分析差異表達的miRNAs，結果發現主動脈夾層患者18個miRNAs上調，56個miRNAs下調。胡孜陽等[28]對5例主動脈夾層患者和4例正常對照進行主動脈組織的miRNAs差異表達分析，發現主動脈夾層患者有3個miRNA表達上調，2個miRNAs表達下調。這些研究均表明在AAD的病變血管中miRNA表達發生顯著改變，但是AAD患者血漿中miRNA是否有改變，miRNA在AAD的臨床診斷及預后方面是否具有價值，目前尚不明確。

本研究首次同時分析AAD患者病變血管組織和外周血血漿中miRNA表達差異，篩選出了4個患者主動脈組織和血漿均表達上調的miRNAs。生物信息學分析提示，這些miRNAs預測的靶蛋白廣泛參與膠原、蛋白聚糖代謝、細胞信號轉導及炎癥等多個與主動脈夾層的發病機制密切相關的分子通路。因此，這些差異表達的miRNAs不僅是潛在的AAD的血清標志物，也很可能參與了AAD的發病過程。

我們的研究雖然有了明確的提示，但也存在一些局限性，例如樣本數較少、只關注了AAD發病急性期的血漿水平等。既往的研究提示，miRNA芯片技術雖然可用來高通量篩選差異miRNAs，但存在一定的假陽性，需經大樣本的驗證以減少假陽性。將來，我們課題組將擴大樣本量，進一步驗證這些miRNAs鑒別診斷AAD的特異性和敏感性。在AAD發病的不同時間點上收集血漿，確定miRNA表達變化的時間窗。另外，值得注意的是，雖然本研究發

現AAD患者和正常對照miRNAs表達有差異，但距臨床應用尚有較長距離。由于影像學技術對AAD的診斷具有較高的敏感性和特異性，影像學方法診斷和排除AAD仍是首選。本研究發現AAD患者主動脈組織和血漿均表達上調的4個miRNAs，可能對鑒別診斷急性AAD有一定幫助，但需要更大樣本量的研究予以證實。

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Differential Expression of microRNAs in Aortic Tissue and Plasma in Patients With Acute Aortic Dissection

WANG Xiao-jian, HUANG Bi, FAN Xiao-han, SU Wen-jun, ZHANG Liang, LU Tian-yi, TIAN Li, YANG Yan-min, HUI Ru-tai, ZHANG Shu.
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

Objective: We want to identify the new microRNAs (miRNAs) biomarker for diagnosing the patients with acute aortic dissection (AAD).

miRNA chips; Acute aortic dissection; miRNA differential expression

2014-06-04）

（編輯:曹洪紅）

國家自然科學基金（81170286，81300184）

100037 北京市，中國醫學科學院 北京協和醫學院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫院 心血管疾病國家重點實驗室 （王曉建、惠汝太）， 心律失常中心（樊曉寒、張澍） ，急重癥中心（黃畢、田力、楊艷敏） ，心外科（張良、蘇文君、路天怡）

王曉建 副研究員 博士 主要從事心血管疾病遺傳學及轉化醫學研究 Email:wang_xiaojian@vip.163.com 通訊作者：樊曉寒

Email:ehan4348ff@gmail.com

R541

A

1000-3614（2015）02-0154-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.02.015