不同氯吡格雷療效檢測指標的相關性及與心血管事件的關系

唐寧，徐向東，朱耀武，孫自鏞， 潘瑩瑩，郭小梅，秦瑾，尹世玉

不同氯吡格雷療效檢測指標的相關性及與心血管事件的關系

唐寧，徐向東，朱耀武，孫自鏞， 潘瑩瑩，郭小梅，秦瑾，尹世玉

目的：了解常用氯吡格雷療效檢測指標間的相關性和對心血管事件的預測能力，為選擇合適的檢測方法提供初步依據。

方法：同時使用二磷酸腺苷（ADP）誘導光學濁度法（LTA）血小板聚集試驗、血栓彈力圖（血小板圖）試驗、血管擴張刺激磷蛋白磷酸化試驗（VASP）和CYP2C19基因型分析，檢測接受氯吡格雷治療的178例急性冠狀動脈綜合征患者的血小板功能，根據回訪178例患者6個月發生主要不良心血管事件（MACE）情況，分為MACE組（n=21）和非MACE組（n=157），分析各檢測結果相關性和對不良心血管事件的預測能力。

結果： 以LTA血小板最大聚集率（LTA-PAmax）＞46%、血小板圖ADP誘導的血小板最大振幅（MAADP）＞47 mm和VASP血小板反應指數（VASP-PRI） ＞50%提示氯吡格雷抵抗的發生率分別為27.0%、24.2%和61.2%。178例患者中，CYP2C19快代謝型、中間代謝型、慢代謝型分別為81例（45.5%），72例（40.5%）和25例（14.0%），三型間VASP-PRI均有顯著差異（P＜0.001）并呈基因劑量效應（慢代謝型＞中間代謝型＞快代謝型）；多變量Logistic回歸分析中，LTAPAmax＞46%和MAADP＞47 mm為6個月MACE發生的獨立危險因素[比值比（OR） = 5.99， 95% 可信區間（CI）: 2.00～17.96，P=0.001 及OR=4.72， 95% CI: 1.27～19.67， P=0.013]。

結論： 中國人群中存在較高比例的CYP2C19功能丟失基因型，且與治療后血小板高反應性相關；LTA-PAmax與MAADP是接受氯吡格雷治療的急性冠狀動脈綜合征患者發生不良心血管事件更有效的預測指標。

氯吡格雷；血小板功能檢測；CYP2C19基因型

Methods: There were 4 tests conducted at the same period of time, ①ADP induced light transmission aggregometry (LTA), ②thrombelastography (TEG), ③vasodilator-stimulated phosphor protein phosphorylation (VASP) and ④CYP2C19 loss of function genotype analysis. A total of 178 ACS patients with clopidogrel treatment were retrospectively studied, the patients were divided into MACE group, n=21 and Non-MACE group, n=157 to compare the effect of different test with the predictive value for MACE occurrence at 6 months after medication.

Results: The ADP-induced maximum platelet aggregation rate (LTA-PAmax) ＞ 46%, ADP-induced plateletfibrin clot strength (MAADP) ＞ 47mm and VASP platelet reactivity index (VASP-PRI) ＞ 50% indicating the occurrence rate for clopidogrel resistance were at 27.0%, 24.2% and 61.2% respectively. The CYP2C19 genotype

analysis presenting the patients with extensive metabolizers (EMs), intermediate metabolizers (IMs) and poor metabolizers (PMs) were at 81 (45.5%), 72 (40.5%) and 25 (14.0%) respectively. The VASP-PRI values were different among the patients with EMs, IMs and PMs as PMs ＞ IMs ＞ Ems, P＜0.001. Multivariate analysis demonstrated that LTA-PAmax ＞ 46% and MAADP＞ 47mm were the independent risk factors for MACE occurrence in ACS patients at 6 months after medication (OR: 5.99, 95% CI: 2.00- 17.96, P=0.001) and (OR: 4.72, 95% CI: 1.27-19.67, P=0.013).

Conclusion: There was higher ratio of CYP2C19 loss of function genotypes, which might be related to higher platelet reactivity after medication. LTA-PAmax and MAADPwere the better predictors for MACE occurrence in ACS patients after clopidogrel treatment.

(Chinese Circulation Journal, 2015, 30:144.)

氯吡格雷作為急性冠狀動脈（冠脈）綜合征及經皮冠脈介入治療手術患者的主要治療藥物，已是使用最為廣泛的抗血小板藥物之一，但其抗血小板效果存在個體差異，即氯吡格雷抵抗現象。為了評估氯吡格雷療效繼而為患者制定個性化的治療方案，減少血栓及出血事件的發生，目前有越來越多的血小板功能檢測方法問世，用以了解氯吡格雷治療后血小板的殘余反應性。本研究同時使用目前常用的幾種血小板功能檢測方法，對應用氯吡格雷抗血小板治療的急性冠脈綜合征患者的血小板功能進行檢測，并評估檢測結果與預后的相關性，試圖對各項檢測方法的指標進行初步比較，篩選出指導抗血小板治療更有價值的方法。

1 資料和方法

研究對象：2012-12-10至2014-01-31入我院心血管科治療患者。納入標準：診斷為急性冠脈綜合征并常規使用氯吡格雷治療的患者，排除標準：患血小板功能缺陷疾病，血小板計數＜100×109/L，常規服用口服抗凝藥期間，一個月內接受過大型手術。對所有納入對象回訪6個月內主要不良心血管事件[MACE，包括心原性死亡、非致死性心肌梗死、（再次）接受血運重建術]發生情況，根據6個月內是否發生MACE分為MACE組（n=21）和非MACE組（n=157）。

標本采集和處理：采集標本時間為距服用氯吡格雷負荷劑量至少12 h，或服用氯吡格雷維持劑量期間，距終止使用血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑替羅非班至少48 h。每位患者分別使用含3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑及肝素鋰抗凝劑真空管采集空腹全血。枸櫞酸鈉抗凝血1 000 r/min離心10 min制備富血小板血漿，3 000 r/min離心10 min制備貧血小板血漿，用于血小板聚集試驗。

檢測方法：①血小板聚集試驗：采用光學濁度法（LTA），以終濃度5 μmol/L的二磷酸腺苷（ADP）為誘導劑，在AggRAM血小板聚集儀（美國HELENA公司）上檢測5 min內LTA血小板最大聚集率（LTA-PAmax），使用枸櫞酸鈉抗凝標本2 h內完成檢測。②血栓彈力圖（血小板圖）試驗：使用5000型血栓彈力圖儀（美國血液技術公司）及其ADP檢測試劑盒，按照試劑說明書的方法，檢測ADP誘導的血小板最大振幅（MAADP），使用枸櫞酸鈉抗凝標本及肝素鋰抗凝標本2 h內完成檢測。③血管擴張刺激磷蛋白磷酸化試驗（VASP）：采用流式細胞術，使用BD FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）及VASP檢測試劑盒（法國STAGO公司），按照試劑說明書的方法，檢測血小板反應指數（PRI），使用枸櫞酸鈉抗凝標本24 h內完成檢測。④CYP2C19基因型分析：采用基因芯片技術，使用CYP2C19基因檢測試劑盒（上海百傲公司），檢測CYP2C19*1、*2、*3等位基因， *1/*1基因型為快代謝型，*1/*2或*1/*3基因型為中間代謝型，*2/*2、 *3/*3或*2/*3基因型為慢代謝型，枸櫞酸鈉抗凝標本采集后-70℃冷凍保存，6個月內完成檢測。

統計學分析：使用SPSS 13.0統計軟件，對不同預后及不同CYP2C19代謝型間血小板反應性比較采用Man-Whitney U檢驗，率的比較采用卡方檢驗。評估6個月發生MACE的獨立危險因素采用多因素Logistic回歸分析，并了解各實驗室指標對MACE發生的陽性及陰性預測值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

整個觀察期間15例患者失訪或未堅持用藥，最終納入178例急性冠脈綜合征患者并進行血小板功能檢測。其中101例為不穩定型心絞痛，77例為急性心肌梗死，這些患者中147例接受了經皮冠脈介入治療手術。175例同時服用氯吡格雷和阿司匹林，使用常規劑量氯吡格雷（300 mg負荷劑量，75 mg維持劑量）的有168例，使用加強劑量氯吡格雷（600 mg負荷劑量，150 mg維持劑量）的有10例。

各項血小板功能試驗檢測治療后血小板反應性：根據以往研究建議[1，2]，分別以5 μmol/L ADP誘導LTA-PAmax ＞46%、血小板圖MAADP＞47 mm及VASP-PRI＞50%作為氯吡格雷抵抗的判斷閾值。178例患者中，血小板聚集試驗提示氯吡格雷抵抗發生率為27.0%（48例），血小板圖試驗提示氯吡格雷抵抗發生率為24.2%（43例），兩種方法間氯吡格雷抵抗發生率差異無統計學意義（P＞0.05）；而VASP試驗提示氯吡格雷抵抗發生率為61.2%（109例），顯著高于前兩種方法的指標（P＜0.05）。

CYP2C19各基因型及治療后血小板反應性間的比較：納入的178例患者中CYP2C19快代謝型、中間代謝型、慢代謝型分別為81例（45.5%）、72例（40.5%）和25例（14.0%），三者的VASP-PRI分別為（49.0±17.5）%、（60.4±13.7）%和（73.2±8.9）%，兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.001），慢代謝型最高，快代謝型最低；而三者的LTA-PAmax分別為（32.1±19.3）%、（30.6±17.2）%和（46.0±23.0）%；MAADP分別為（37.7±13.7）mm、（44.5±12.1）mm和（51.9±13.0）mm，慢代謝型LTA-PAmax與MAADP均較快代謝型、中間代謝型更高（P＜0.001），快代謝型、中間代謝型間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。圖1

各項檢測指標與預后的相關性：對178例患者進行6個月回訪，其中非MACE組157例，MACE組21例，包括5例心原性死亡，13例發生非致死性心肌梗死，3例再次接受經皮冠脈介入治療手術。MACE組與非MACE組間臨床資料、治療后血小板反應性和基因型的比較見表1。血管緊張素轉換酶抑制劑使用率、LTA-PAmax和MAADP差異均有統計學意義 （P＜0.05）。利用多因素Logistic回歸分析，將上述檢測變量及表1中P＜0.1的臨床變量（糖尿病病史、使用血管緊張素轉換酶抑制劑、使用他汀類藥、CYP2C19慢代謝型）作為自變量，評估其與6個月MACE相關性，LTA-Pamax及MAADP均與MACE發生獨立相關[比值比（OR）= 5.99， 95%可信區間（CI）: 2.00～17.96， P=0.001 及OR = 4.72，95% CI: 1.27～19.67， P=0.013]，除血管緊張素轉換酶抑制劑使用率外，其他臨床變量均被排除出模型（表2）。LTA-PAmax＞46%對6個月MACE的陽性預測值（33.3%）及陰性預測值（97.6%）均為最高，而VASPPRI＞50%的陽性預測值（11.6%）最低，CYP2C19慢代謝型的陰性預測值（90.1%）最低。表3

圖1 不同CYP2C19基因型的治療后血小板反應性

表1 兩組患者間臨床資料、治療后血小板反應性和基因型的比較

表2 以6個月主要不良心血管事件發生為因變量的多因素Logistic回歸分析

表3 各項檢測變量對主要不良心血管事件的預測能力（%）

3 討論

目前用于氯吡格雷療效監測的方法越來越多，方法間檢測原理、診斷效率各異，為了選擇合適的臨床實驗室檢測方法，有必要了解這些方法指標間的相關性及其與預后的關系。本研究使用的方法中，血小板聚集試驗使用最為廣泛，設備要求較低，為血小板功能試驗的“金標準”，局限包括需進行樣本前處理、對操作人員熟練程度有較高要求；血小板圖試驗利用血栓彈力描記術檢測全血標本，操作簡便，可床旁檢測，局限包括成本較高、臨床研究數據較少[3]；另外血小板聚集試驗與血小板圖試驗檢測均基于血小板聚集的發生，在評估氯吡格雷療效時，還可能受其他抗血小板藥物影響，如環氧化酶抑制劑（阿司匹林）的協同效應，及血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑對血小板聚集最終途徑的阻斷效應；而VASP檢測基于P2Y12受體途徑的活化，是特異性最高的P2Y12受體抑制劑檢測方法，不受其他抗血小板藥物的影響，其局限包括步驟較繁瑣、設備要求較高[1]。

細胞色素P450（CYP）在氯吡格雷的代謝中起重要作用，既往研究顯示，非功能性等位基因如CYP2C19 *2、*3攜帶者的氯吡格雷血漿活性代謝物水平較低，導致體內殘留血小板活性增高，因此CYP2C19基因型檢測被認為可預測患者對氯吡格雷的敏感性繼而指導治療[4]。目前常用的基因芯片法操作簡便、結果可靠。本研究中CYP2C19快代射型、中間代射型、慢代射型間VASP-PRI水平均差異顯著，證實了中國人群中CYP2C19非功能性等位基因與氯吡格雷治療后血小板殘余反應性密切相關。但亞洲人群較高的CYP2C19功能丟失基因多態性發生率（本研究為54.5%，日本一項研究達60.0%[5]，與以往對亞洲人群的研究[6-9]一致），及VASP-PRI提示氯吡格雷抵抗發生率過高（本研究為61.2%），可能導致CYP2C19基因型分析與VASP-PRI反映中國人群氯吡格雷抵抗的特異度降低。事實上，一項關于CYP2C19基因型、氯吡格雷代謝、心血管事件的Meta分析表明，即使在CYP2C19非功能性等位基因攜帶率較低的西方人群中，基因型與心血管事件間也沒有發現顯著相關性[10]。Judge等[11]的研究表明，當VASP檢測PRI在60%～100%之間時，P2Y12受體的實際阻斷數量差異很大。Bonello等[12]觀察到接受普拉格雷治療患者VASP檢測結果可預測隨訪1年內發生缺血及出血事件，他的研究中使用PRI＞53.5%定義治療后血小板高反應性，僅22.3%的患者被認為使用普拉格雷后血小板活性抑制不足，這也提示治療后血小板高反應性的發生比例對VASP-PRI的預測能力有重要影響。

由于多數服用氯吡格雷的患者同時服用阿司匹林等抗血小板藥，相對于VASP與CYP2C19基因檢測，基于血小板聚集終點的LTA血小板聚集試驗和血小板圖試驗可能更能反映多種藥物的協同作用，本研究多因素分析中僅LTA-PAmax和MAADP與急性冠脈綜合征患者6個月內發生MACE獨立相關，這與以往對LTA-PAmax和MAADP與缺血事件相關性的研究結果一致[2]。質子泵抑制劑的使用在不同預后人群間沒有顯著差異，因此其與氯吡格雷聯用可能增加的缺血事件風險[13]不會影響我們的研究結論。有趣的是，我們的結果提示血管緊張素轉換酶抑制劑的使用也與預后獨立相關，表明心力衰竭相關治療不足也可能是缺血事件的危險因素。

雖然血小板功能試驗所檢測到的血小板殘余反應性已被大量研究證實與急性冠脈綜合征及經皮冠脈介入治療手術后患者缺血事件的發生相關[12,14,15]，但最近的一個大規模臨床研究結果表明，依據一個血小板功能試驗（如Verifynow）結果進行抗血小板治療方案調整，并未顯著減少缺血事件的發生[16]。有人認為由于血小板活化途徑多樣，依靠單個功能試驗未必能夠反映其整體活化狀態，因此依據基于不同方法學的多個功能試驗結果來調整抗血小板治療方案，可能是抗血小板個性化

治療的出路[17]。

本研究表明中國人群中存在較高比例的CYP2C19功能丟失基因型，并與治療后血小板高反應性相關；LTA-PAmax與MAADP可能是預測接受氯吡格雷治療急性冠脈綜合征患者發生MACE更有價值的指標。本研究樣本量有限，要明確各類實驗室方法的指標及其聯合應用的臨床指導意義，有賴于更大樣本量、干預性的臨床研究。

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Comparison of Different Testing Method on Clopidogrel Effect With the Predictive Value of Major Adverse Cardiovascular Event Occurrence in ACS Patients

TANG Ning, XU Xiang-dong, ZHU Yao-wu, SUN Zi-yong, PAN Ying-ying, GUO Xiao-mei, QIN Jin, YIN Shi-yu.
Department of Laboratory Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan (430030), Hubei, China

Objective: To compare different testing method on clopidogrel effect with the predictive value of major adverse cardiovascular event (MACE) occurrence in ACS patients in order to provide the proper examination in clinical practice.

Clopidogrel, Platelet function test, CYP2C19 genotype

2014-07-25）

（編輯：漆利萍）

430030 湖北省武漢市, 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 檢驗科（唐寧、徐向東、朱耀武、孫自鏞、潘瑩瑩），心血管科（郭小梅、秦瑾），綜合醫療科（尹世玉）

唐寧 主管技師 碩士 研究方向：血栓與止血實驗室診斷 Email：tonyjesus@126.com 通訊作者： 孫自鏞 Email：ziyongsun@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2015）02-0144-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.02.013