比率型CN-檢測熒光探針的合成與應用

陳　頌，侯　鵬，王　靜，劉　磊，王　鑫

（齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

比率型CN-檢測熒光探針的合成與應用

陳頌，侯鵬，王靜，劉磊，王鑫

（齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

利用CN-誘導的邁克爾加成反應阻斷探針的分子內電荷轉移過程（ICT），成功設計合成一種新型的熒光比率型CN-熒光探針。該探針對CN-具有顯著的熒光比率響應，其熒光光譜藍移128 nm。相對于其他干擾離子，探針對CN-具有較高的選擇性和專一性。通過以上實驗為監測CN-濃度提供一個簡單有效并具有較高靈敏度的分析方法。

熒光探針；比率型；分子內電荷轉移；香豆素衍生物

0　引　言

由于陰離子在生物體系和化學過程中具有重要的作用，近年來開發合成檢測陰離子的熒光探針得到了極大關注[1-5]。CN-是眾多陰離子中尤為重要的一類，被廣泛用于合成纖維、樹脂、除草劑和金的提取工藝過程中。然而，CN-的毒性對環境及生物造成的危害也不容忽視，當機體通過肺、胃腸道和皮膚攝入過量的CN-會導致嘔吐、抽搐、意識喪失，甚至死亡[6-8]。因此，開發高效的CN-濃度監測技術具有非常重要的現實意義。目前，文獻所報道的檢測CN-的熒光探針，大部分是依賴單波長檢測熒光增強的原理，信號表達容易受到物質濃度、外界環境以及設備穩定性等因素的影響[9-11]。相比之下，通過雙波長比值自校準方式發展的比率型熒光探針能有效消除檢測中的不確定因素，從而提高方法的可信度[12-13]。本文以香豆素衍生物為熒光團，通過調節分子內電荷轉移（ICT）過程，設計合成了一種檢測CN-的比率型熒光探針1。當探針分子1與CN-作用后，由于CN-具有較強的親核性，可以進攻探針分子結構中的不飽和雙鍵，導致分子內電荷轉移過程（ICT）被中斷，引起分子紫外光譜和熒光光譜的變化，利用反應前后兩個波長的比值，從而建立一種檢測CN-的方法。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

苯并噻唑-2-乙腈（99%，Xiya Reagent Research Center）；石油醚（上海思域化工科技有限公司）；哌啶（天津市福晨化學試劑廠）；二氯甲烷（天津市東麗區天大化學試劑廠）；無水乙醇（天津市凱通化學試劑有限公司）；測試所用陰離子為四丁基銨鹽（F-，Cl-，Br-，I-，NO3-，HSO4-，ClO4-，AcO-，H2PO4-，均購于上海國藥試劑有限公司）。

1.2實驗方法

將二乙胺基香豆素醛[14]（25 mg，0.1 mmoL）和苯并噻唑-2-乙腈（18mg，0.1mmoL）溶于10mL無水乙醇中，加入1滴哌啶，室溫攪拌3h。反應結束后，抽濾，乙醇洗滌，柱層析分離（石油醚/二氯甲烷=1∶2，ν∶ν）得到產品28 mg（質量分數為70%）即為分子熒光探針1，其合成過程如圖1所示。δH（400 MHz，DMSO-d6）：8.91（1 H，s），8.43（1 H，d，J 0.4），8.12 -8.08（1 H，m），7.90-7.88（1 H，m），7.52-7.42（3 H，m），6.61（1 H，s），6.60（1 H，s），3.49（4 H，dd，J 9.4，9.6），1.28（6 H，d，J 9.6），HRMS Calcd for：401.119.Found：401.120。

圖1　探針1的合成及CN-的識別機理

2　結果與分析

2.1紫外光譜和熒光光譜研究

在紫外-可見吸收光譜中（見圖2），探針1溶液（20μmol/L）的最大吸收峰出現在532nm，當加入CN-后，532 nm處的吸光度降低，同時在350 nm處出現一個新的吸收峰，隨著CN-濃度的增加（0～35μmol/L），350nm處的吸光度逐漸增加，而532nm處的吸收峰逐漸消失。反應前后，探針溶液的吸收光譜藍移了182nm。同時，探針溶液的顏色由紅色變為淡黃色，適于裸眼檢測。如圖3所示，在熒光光譜中（440nm激發下），探針分子（10μmol/L）的最大發射峰出現在616nm，隨著CN-的加入，最大吸收峰藍移至488nm，向探針溶液中加入CN-，616nm與488nm處熒光強度的比值較單獨的探針溶液增強了45倍，反應前后，熒光光譜藍移了128nm。這種藍移現象主要是由于CN-進攻探針的不飽和雙鍵發生邁克爾加成反應，使探針分子的分子內電荷轉移（ICT）過程被抑制，從而引起紫外和熒光光譜的變化。

圖2　探針1（20μmol/L）與CN-（0～35μmol/L）反應的紫外吸收光譜變化情況

2.2檢測限

通過分析探針1與CN-作用的熒光發射光譜數據，如圖4所示，以熒光強度比值（I488/I616）為縱坐標，CN-濃度為橫坐標作圖，得到一條標準曲線，擬合后得到的方程為y=0.13167+0.03244x（r=0.9888）。比率型熒光探針提供了依靠內置校正消除環境影響的優勢手段，更重要的是，可以提高熒光的動態測量范圍，探針1（10μmol/L）能夠有效檢測CN-的濃度范圍為0～14μmol/L。根據文獻報道的方法[15]，計算CN-檢測限為0.52×10-6mol/L，以上結果表明，該探針可以對CN-進行定量檢測。

圖3　探針1（10μmol/L）與CN-（0～14μmol/L）反應的熒光光譜（λex=440nm）變化情況（激發電壓：700 V,狹縫寬度：2.5nm，2.5nm）

圖4　探針1（10μmol/L）與不同濃度CN-（0～14μmol/L）反應的熒光比率變化情況

圖5　探針1（10μmol/L）與CN-（0～14μmol/L）以及等量（25 μmol/L）的不同測試物（Cl-，F-，Br-，I-，AcO-，NO3-，ClO4-，HSO4-，H2PO4-）反應的紫外光譜比率變化情況

2.3選擇性和干擾實驗

為了評估探針1分子對CN-的專一識別能力，本文選擇了一些典型的測試物（Cl-，F-，Br-，I-，AcO-，NO3-，ClO4-，HSO4-，H2PO4-）對探針1分子的選擇性進行研究。在相同條件下，向探針溶液中加入等量的各種測試物，紫外光譜比率及熒光光譜變化如圖5、圖6所示。若只有CN-的加入，會與探針分子的不飽和雙鍵發生邁克爾加成反應，阻斷探針分子ICT過程的進行，導致探針溶液的熒光發射峰較大的藍移，對比反應前后熒光比率也可以清晰看出加入CN-（14 μmol/L），熒光比率增強明顯（I488/I616=7.8），相比之下，其他測試物（25μmol/L）與探針1（10μmol/L）作用后，探針分子的熒光光譜幾乎沒有變化，相應的熒光比率變化不大（I405/I542=0.16～0.28）。以上研究結果表明，該探針是一個具有高度選擇性的CN-探針。

圖6　探針1（10 μmol/L）與CN-（0～14 μmol/L）以及等量（25 μmol/L）的不同測試物（Cl-，F-，Br-，I-，AcO-，NO3-，ClO4-，HSO4-，H2PO4-）反應的熒光光譜（λex=440 nm）變化情況（激發電壓：700 V,狹縫寬度：2.5 nm，2.5 nm）

3　結束語

本文成功合成了一種基于香豆素染料為母體識別CN-的新型熒光探針1。相對于其他常見的陰離子，探針分子表現出高度的選擇性和專一性。探針1與CN-作用后，紫外光譜藍移了182nm的同時，溶液的顏色也從紅色變為淡黃色，清晰的顏色變化可以用于裸眼檢測。這一實驗建立了一種裸眼和熒光比率檢測的研究方法，證明其在CN-濃度的監測方面具有潛在的應用能力。

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Synthesis and application of ratiometric fluorescent probe for CN-determination

CHEN Song，HOU Peng，WANG Jing，LIU Lei，WANG Xin
（College of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China）

It reports a new type of CN-fluorescence ratiometric fluorescent probe by using the CN-induced Michael addition reaction to block intermolecular charge transfer process（ICT）.The probe displayed remarkable fluorescence ratio towards CN-.With the addition of CN-，the fluorescence spectrum of the probe blue shifted by 128 nm.The probe exhibited high selectivity and sensitivity towards CN-over other interfering ions.Based on the result，it provides a simple，effective and high sensitivity analysis method for monitoring the concentration of CN-.

fluorescence probe；ratiometric；ICT；coumarin derivative

A

1674-5124（2015）12-0045-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.12.012

2015-05-01；

2015-06-30

齊齊哈爾市科技廳科學技術研究項目（SFGG201327）

陳頌（1983-），男，江蘇連云港市人，講師，博士，研究方向為熒光探針的合成與應用。