豬蛔蟲各期蟲體基因片段（2G04）表達情況分析

曾玉梅　福建省武平縣下壩鄉畜牧獸醫站364309

豬蛔蟲各期蟲體基因片段（2G04）表達情況分析

曾玉梅福建省武平縣下壩鄉畜牧獸醫站364309

采用半定量RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）方法，探討編碼鐵蛋白基因（命名為2G04）在豬蛔蟲不同發育期蟲體的表達豐度。結果表明該基因在雄蟲中沒有檢測到表達量，在其他各期幼蟲均有較高表達，其中在蟲卵中表達量最高。試驗結果可為豬蛔蟲的發育生物學和免疫防治奠定基礎和提供科學依據。

豬蛔蟲各期蟲體半定量RT-PCR基因表達

豬蛔蟲屬于蛔蟲科蛔蟲屬，為黃白色或淡紅色大型線蟲。其發育不需要中間宿主，一條雌蛔蟲能產卵20萬個[1]。豬蛔蟲感染極為普遍，在衛生條件差、飼養不足或品質差、擁擠的豬群中最易感染。其蟲卵有三層軟膜，對理化因素抵抗力很強，一年四季均可發生。豬蛔蟲和人蛔蟲在形態上極其相似，在農村，人群和豬群蛔蟲感染往往并存。養豬業是我國養殖業的支柱產業之一，在中國，豬肉一直是主要的肉食產品。因此，在蠕蟲耐藥性和藥物殘留普遍存在的今天，對豬蛔蟲進行分子生物學研究具有重要意義。

豬蛔蟲幼蟲移行過程對豬造成的危害以對肺臟和肝臟的危害較大，造成肺臟和肝臟的小血管破裂，造成大量的小點出血和水腫，嚴重感染者可伴發蛔蟲性肺炎，引起咳喘，同時可引發氣喘病、豬瘟等其他疾病[2]。豬蛔蟲病流行和分布廣泛，是一種常見的寄生蟲病，由豬蛔蟲寄生在豬的小腸中而引起的，主要危害3月齡至6月齡仔豬。當成蟲大量寄生時常引起小腸阻塞，豬體消瘦，貧血，被毛粗糙，生長發育不良，有的成為僵豬，肺部被幼蟲侵害引起蛔蟲性肺炎時，體溫上升，呼吸急促，咳嗽，食欲減少及精神不振。有時蟲體鉆入膽管，阻塞膽道，引起腹痛和黃疸。成蟲產生的毒素可作用于中樞神經系統，引起神經癥狀，陣發性痙攣，興奮和麻痹，還可引起蕁麻疹等[3]。豬蛔蟲成蟲長圓柱形，形似蚯蚓，頭、尾兩端逐漸變細，尾部呈圓錐形。雌蟲消化道末端開口于肛門，生殖器官為雙管型。據報道，在四川發現一例三管型雌性生殖系統的豬蛔蟲[4]，在江蘇發現一例單子宮的豬蛔蟲[5]。雄蟲消化道末端與射精管共同開口于泄殖腔，有單管生殖器，一對交合刺。受精卵呈寬橢圓形，卵殼厚，通常由3層構成，最外層是蛋白質構成的蛋白膜，厚且有黏性，使蟲卵對外界環境條件具有較強抵抗力，在蛔蟲的流行病學上具有重要意義。

目前，對豬蛔蟲病的研究主要在藥物治療和預防兩方面，例如，抗蠕蟲藥的研發，但由于藥物的濫用或長時間使用，常常引起蛔蟲的耐藥性和藥物殘留等問題。因此，免疫防治成為新的研究方向之一。由于寄生線蟲的不同發育期具有的生物學特性不相同，因此，通過選擇性抑制或阻斷某一特定發育期豬蛔蟲的發育，使豬蛔蟲的傳播受阻或降低成為可能。現今，國內外這方面的資料十分匱乏，只有從幾種寄生線蟲克隆出數量很少的呈期特異性表達的基因。為此，在已構建豬蛔蟲感染期幼蟲消減cDNA文庫的基礎上，以β-actin基因為內參，采用半定量RTPCR技術，探討2G04基因在豬蛔蟲各期的表達豐度，并為進一步闡明豬蛔蟲的發育生物學奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料和設備以豬蛔蟲各期蟲體總RNA為材料，應用ReverTra Ace-a-TM試劑盒、rTaq酶溶液，PCR儀、Bio-RAD電泳系統、凝膠圖像分析系統、微量取液器（2μL、200μL、1 000μL）、電泳儀（DYCP-31BN）、Thermo Forma低溫冰箱等設備。

1.2方法

1.2.1逆轉錄反應參照ReverTraAce-a-TM試劑盒說明書并做適當的調整，根據不同樣品RNA濃度調整加入的RNA體積，使RNA初始量都為1μg。反應體系見表1。

表1　逆轉錄反應體系

反應條件為：30℃10min、42℃40 min、99℃5 min、4℃5 min。

1.2.2內參β-actin基因的PCR擴增反應內參基因β-actin參考鄧艷（2006）設計的引物[6]和反應條件并做適當的調整進行擴增。上游引物為5'-CTC GAA ACA AGA ATA CGA TG-3'，下游引物為5'-A CA TGT GCC GTT GTA TGA TG-3'。反應體系見表2。

反應條件如下：94℃預變性5 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，25個循環；72℃后延伸10 min。

表2　內參基因PCR擴增反應體系

表3　Mg2+優化PCR反應體系

1.2.32G04基因的PCR擴增

1.2.3.1引物設計以已知的2G04EST序列（基因登錄號：ES291034）為模板，利用primer自動搜索結合oligo軟件人工分析設計引物。引物合成后加入DEPC水稀釋為10 pmol/μL，分裝后-20℃保存備用。引物序列為：上游引物5'AAGGTGGTTCGG CTGTTC 3，下游引物5'CTCGTCCTGCTCGTTTCA 3'。

1.2.3.2 Mg2+濃度優化通過構建不同Mg2+濃度的PCR反應體系來確定每對引物進行PCR擴增的最佳Mg2+濃度。構建的Mg2+濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L，PCR反應后，取5μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。根據條帶亮度和特異性，判斷對應引物適合的Mg2+濃度。Mg2+優化PCR體系見表3。

PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s、引物退火溫度30 s、72℃延伸30 s，30個循環；72℃后延伸10 min。

1.2.3.3退火溫度的優化一般情況下，退火溫度比引物的解鏈溫度低5℃左右。根據PCR儀的程序設定退火的梯度進行PCR擴增，取5μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據其亮度和特異性，確定其適宜的退火溫度。反應條件同Mg2+優化的PCR條件。見表4。

表4　退火溫度優化PCR反應體系

1.2.3.4循環數的優化線性擴增范圍內的循環數對半定量RT-PCR很重要，設定2G04基因以26、28、30、32、34、36六個梯度進行循環數優化，取5μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。用Quantity One軟件對電泳條帶進行光密度測定，選擇循環數在線性范圍內且電泳條帶好的次數作為最佳次數。

1.2.3.5豬蛔蟲感染期幼蟲差異基因在不同發育期的表達分析以2G04基因與內參基因β-actin的積分光密度比值代表2G04基因的mRNA含量。根據優化結果，選擇最佳的PCR反應條件對感染期幼蟲差異表達基因在不同發育期的表達情況進行研究。在同一次PCR反應中進行反應，取5μL PCR產物進行瓊脂糖電泳，用Quantity One軟件對電泳條帶進行光密度測定。

1.2.4RT-PCR產物測序分析將RT-PCR產物進行測序，將測序結果與已知EST片段進行比對分析。

2　結果和分析

2.1內參基因擴增內參基因β-actin在蟲體各期表達穩定，一般不受外界環境的變化而影響其表達水平。

2.2Mg2+濃度優化所有的熱穩定DNA聚合酶都需要有游離的二價陽離子，通常是用Mg2+激活DNA聚合酶[7]。因此，Mg2+是影響PCR反應的一項重要因素。根據Mg2+濃度優化電泳結果分析，該基因的最佳Mg2+濃度為1.0 mM。

2.3退火溫度優化復性過程（即退火）采用的溫度很關鍵，如果復性溫度太高，擴增效率將會非常低，因為寡核苷酸引物不能與模板很好地復性。如果復性溫度太低，引物將產生非特異性復性，從而導致非特異性DNA片段的擴增[6]。不同的序列其最佳的退火溫度也不同。根據退火溫度優化電泳結果分析，2G04基因的最佳退火溫度為47.5℃。

2.4循環數對PCR產物光密度值的影響半定量PCR分析的原理是通過PCR產物來推斷樣品中原始模板的量，該技術一般要求在PCR擴增的指數期進行[8]。PCR擴增產物的量與循環數之間有一線性的關系，前期擴增產物的量隨循環數的遞增而成比例增加，但由于DNA聚合酶活性下降和溶液中反應底物不斷減少，擴增產物的量將會達到一個平臺。因而，循環數的優化對半定量PCR來說至關重要。表達豐度不同的基因其半定量PCR分析的循環數亦不一樣。根據電泳結果，2G04基因在36循環數內擴增在指數增長期。

2.5豬蛔蟲感染期幼蟲差異基因（2G04）在不同發育期的半定量RT-PCR結果取5μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，用Quantity One軟件對每條電泳條帶進行光密度測定，用各目的基因與內參基因β-actin積分光密度的比值代表目的基因在不同發育期的表達量。結果表明，2G04基因除了在雄蟲發育期不表達外，在其他發育期都有表達，在蟲卵中表達量最高。

2.6測序結果分析將測序所得的序列與目的基因已知EST序列片段進行比對，堿基序列98%相同，證明RT-PCR擴增片段是目的片段，且沒有發生堿基突變。

3　討論

豬蛔蟲感染廣泛，是豬體內最常見的寄生蟲，流行性強，給集約化養殖和散戶都造成一定程度的損失，是引起養豬業損失最大的寄生蟲病之一。且豬蛔蟲的幼蟲在人和動物體內移行會引起一系列的疾病[9-11]，因此，對豬蛔蟲的研究和控制刻不容緩。

傳統的貝爾曼氏法分離L3、L4經常有許多雜質存在，即使采用不同孔徑的分樣篩過濾，也總會有與蟲體大小差不多的雜質存在，而且耗時費事[12]。Murrell等（1997）采用終濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠法將含有幼蟲的碎組織凝固后，浸泡在0.9%生理鹽水中收集幼蟲[13]，這樣收集的幼蟲純度很高，數量卻偏少，當要獲得大量幼蟲時，因不能一次性獲得大量蟲體，其試驗次數和成本必然增加，本研究將兩種方法相結合，但使用較低濃度瓊脂凝膠（0.4%）收集幼蟲，結果表明該方法獲得的幼蟲不僅數量多，而且純度高。對培養含有感染性幼蟲蟲卵和分離各發育期幼蟲的方法和條件進行優化，獲得了大量純度較好的蟲卵和幼蟲，并獲得良好質量的蟲卵、各期幼蟲及成蟲的總RNA。用化學脫鞘法結合玻璃珠振蕩的物理脫鞘方法能夠得到大量純度較好的感染期幼蟲。相較于其他研究者所采用的方法[14-16]，通過次氯酸鈉氧化卵殼再加以玻璃珠振蕩的方法具有操作簡單、純度好、分離率高等優點。豬蛔蟲各期蟲體總RNA的提取是本研究的一個關鍵，總RNA的純度直接影響后面的逆轉錄反應。為此本研究在試驗方法上做了一些改進，樣品從液氮中取出時就加入少量的Trizol，這樣既能加速樣品在凍存管的溶解，使樣品能夠更快拿出在研磨上研磨，也能更有效地防止RNA降解。

近年來半定量RT-PCR常被用來定量測定特異性mRNA豐度，其原理主要是通過在線性增長期內目的片段的擴增強度與內參基因的擴增強度相比較，從而判斷目的基因的拷貝數[17]。該方法的優點在于mRNA經反轉錄后，再由PCR數次循環，其產物的量以指數形式增長，因此，模板的濃度即使比較低也能夠檢測得到。選擇合適的看家基因是關鍵之一，本試驗選擇在各組織和細胞穩定表達的β-actin作為內參基因。由于試驗設計的目的片段與內參基因片段相差不大，而且內參的豐度一般遠遠大于目的基因的豐度，使得二者要是同時在線性范圍內擴增往往導致內參基因已飽和而目的基因還不飽和，因此，試驗采用同一次PCR反應，在參照鄧艷（2006）研究的基礎上，內參基因選用25個循環[6]，目的基因2G04根據循環數優化的結果而選擇34個循環數，從而保證兩個基因的擴增都在線性增長期。

在豬蛔蟲感染期幼蟲已構建的cDNA文庫基礎上，采用半定量RT-PCR對2G04基因在5個發育期的表達情況進行分析。試驗結果顯示，該基因只在雄蟲不表達。將目的基因2G04在GenBank中的非冗余數據庫進行blast分析，發現與異色鮑屬軟體動物編碼ferritin的基因有61%相似性，與秀麗隱桿線蟲編碼Ferritin family member（ftn-2）的基因有59%相似性。鐵蛋白（Ferritin）是普遍存在于生物體內的一種保守性較高的多功能多亞基蛋白，具有調節體內鐵的含量和細胞增殖、抗氧化等重要作用，說明該目的基因和機體的免疫反應有一定的相關性。

[1]張道永林毅.獸醫手冊[M].成都:四川科學技術出版社, 2001.

[2]甘孟侯.科學養豬問答[M].北京:中國農業出版社,2003.

[3]王旭,楊晉.豬蛔蟲有三管型雌性生殖系統的解剖記錄[J].四川動物,2000,19（4）:251.

[4]Douvres F W,Tromba F G,Malakatis G M.Morphogenesis and migration of Ascaris suum larva developing to fourth stage in swine[J].JParasitol,1969,55（4）:689-712.

[5]薛俊增.單子宮豬蛔蟲一例[J].四川動物,1994,13（2）:53.

[6]鄧艷.豬蛔蟲雄蟲cDNA文庫的構建及性別差異表達基因的篩選和鑒定[D].廣州:華南農業大學,2006.

[7]薩姆布魯克J,拉塞爾D W.分子克隆實驗指南[M].3版.黃培堂,譯.北京:科學出版社,2002:596-618.

[8]黃翠琴.豬蛔蟲感染期幼蟲差異表達基因的篩選及其功能研究[D].廣州:華南農業大學,2007.

[9]Inatomi Y,Murakami T,Tokunaga M,et al.Encephalopathy caused by viscerallarva migrans due to Ascaris suum[J].J Neurol Sci,1999,164（2）:195-199.

[10]Nakamura-uchiyama F,Tokunaga Y,Suzuki A,et al.A case of Ascaris suum visceral larva migrans diagnosed by using A.suum larval excretory-secretory（ES）antigen[J]. Scand JInfect Dis,2006,38（3）:221-224.

[11]李國清.獸醫寄生蟲學[M].1版.北京:中國農業大學出版社,2006:135-140.

[12]張榮光,崔晶,毛福榮,等.旋毛蟲移行幼蟲收集方法的研究[J].河南醫學研究,1999,8（2）:126-128.

[13]Murrell K D,Slotved H C,Eriksen,et al.Improved method for the recovery of ascaris suum larvae from pig intestinalmucosa[J].J Parasitol,1997,83（2）:321-324.

[14]劉志剛,羅佛全,嚴濤,等.人蛔蟲幼蟲分離制備的動態觀察[J].中國人獸共患病雜志,2004,20（1）:49-51.

[15]Douvres F W,Malakatis G M.In vitro cultivation of Ostertagia ostertagi,the medium stomach worm of cattle.I. Development from infective larvae to egg-laying adults[J]. Jparasitol,1997,83（3）:520-527.

[16]Han Q,Eriksen L,Boes J,et al.Effects of bile on the in vitro hatching,exsheathment,and migration of Ascaris suum larvae[J].Parasitol Res,2000,86:630-633.

[17]劉寶娟,張文兵.鐵蛋白的結構功能及表達調控[J].飼料工業,2009,30（4）:42-46.

The analysis of the expression condition of gene（2G04）in polypide in different developmental phases of Ascaris sum

Zeng Yumei
（Livestock Farm Veterinary Station,Xiaba Township Wuping County,Fujian 364309）

This experiment adopted semiquantitative RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）method to discuss the expression abundance of coding ferritin gene（named 2G04）in polypide in different developmental phases.The result showed that no expression was found in maleworm for this gene,and there have high expression in other different stages,among which the highest expression was found in eggs.The experimental result lays the foundation and provides the scientific basis for the developmental biology and immune control in Ascaris suum.

Ascaris sum different stages of Ascaris suum semi-quantitative RT-PCR differentially expressed gene

A

1003-4331（2015）05-0001-04