花蛤中糖胺聚糖的分離與結構鑒定

林建原，賈康茗，李 堯

（浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100）

花蛤中糖胺聚糖的分離與結構鑒定

林建原，賈康茗，李 堯

（浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100）

目的：以花蛤為提取原料，用多酶水解法提取花蛤中糖胺聚糖，利用紅外光譜法對提取物中的硫酸軟骨素的結構進行分析。采用超高效液相色譜與電噴霧-質譜聯用技術對糖胺聚糖類組分進行研究。方法：色譜柱ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）；保護柱ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard（2.1 mm×5 mm，1.7 ?m）；流動相乙腈-水（體積分數0.2%冰醋酸）的體積比為75∶25；流速0.1 mL/min；進樣20 μL。結果：超高效液相色譜-電噴霧-質譜法可快速定性分離糖胺聚糖組分。結論：本實驗為糖胺聚糖化合物的結構鑒定提供了一種有效的分析方法。

花蛤；糖胺聚糖；硫酸軟骨素；超高效液相色譜-電噴霧-質譜；紅外光譜

糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs），也叫黏多糖、硫酸酯多糖、結締組織多糖，為雜多糖的一種，主要存在于高等動物結締組織中，植物中也有發現。GAGs是動物中蛋白聚糖的糖鏈部分，是多聚陰離子，為長鏈不分支的糖，具有羧基和硫酸基團[1]，是一類由重復的二糖結構單元組成的帶有負電荷的長鏈大分子物質[2]。常見的GAGs有透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、肝素和硫酸乙酰肝素等。GAGs分子是呈酸性的，其原因是GAGs分子中含有己糖醛酸并連有硫酸基團。GAGs因具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、降血脂、增強免疫等生理活性[3-6]，已成為學術界矚目的一類生物高分子。近年來，國內外對大西洋鰩[7]、海星[8]、扇貝[9]等的GAGs進行了研究。貝類在提取過程中，主要采用酶進行酶解[10-12]，以酶解產物為原料提取GAGs，進而測定GAGs的含量。

近年來，超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography UPLC）作為一種新興的色譜分析手段，被廣泛應用到與質譜聯用中[13]，且UPLC具有高速、高分離度、低消耗等特點[14]，特別是針對GAGs的結構分析[15]，更具有顯著的優勢。張小軍[16]利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對GAGs的二糖結構進行了分析。GAGs的定量分析方法主要以比色法[17]、HPLC法和電泳法為主[18-19]。本實驗采用UPLC-電噴霧-質譜（UPLC-electrospray-mass spectrometry，UPLC-ESI-MS）聯用技術對扇貝GAGs的結構進行研究，為進一步開發貝類多糖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫酸軟骨素標準樣品 美國阿拉丁公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；枯草桿菌中性蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；花蛤粉末 自制；乙腈為色譜純，色譜實驗用水均為超純水，其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；十萬分之一分析天平 Sartorius科學儀器（北京）有限公司；AE200S萬分之一天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；Acquity UPLC超高壓液相色譜儀、Acquity UPC2質譜檢測器 美國Waters公司；Vertex70傅里葉紅外光譜儀 德國Brüker公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分離條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1mm× 100 mm，1.7 ?m）；保護柱：ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard（2.1 mm×5 mm，1.7 ?m）；采用二元線性梯度洗脫：流動相A為體積分數0.2%冰醋酸溶液；流動相B為乙腈；流動相梯度組成列于表1；流速0.1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 ?L。

表1 高效液相色譜流動相比例Table1 Solvent composition of HPLC mobile phase hase

1.3.2 色譜與質譜分析條件

電噴霧離子源（負離子）；質量掃描范圍m/z 100～1 000；毛細管電壓3.80 kV；錐孔電壓25.00 V；錐孔氣流量45 L/h；提取電壓2.00 V；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度300℃；脫溶劑氣流量300 L/h。

1.3.3 花蛤中硫酸軟骨素的提取

稱取花蛤粉末5.000 g，以固液比1∶3（g/mL）的比例溶于蒸餾水。先后用質量分數1.3%胃蛋白酶、質量分數1.4%胰蛋白酶、質量分數0.9%枯草桿菌蛋白酶進行酶解。酶解后取酶解液加入體積分數60%乙醇進行醇沉24 h。醇沉后取沉淀用乙醇、丙酮交替洗脫3 次干燥得硫酸軟骨素。將硫酸軟骨素配制成質量分數5%糖液，用稀堿將pH值調至2.0，去沉淀，再將pH值調至7.0去沉淀。上清液透析48 h。加入體積分數5%無水NaAc溶液和1.5 倍體積分數95%乙醇，使醇量達60%，醇沉24 h。棄上清液，沉淀干燥后得GAGs-1。將GAGs-1配制成1%糖液，透析48 h，加入乙醇-乙酸鈉試劑，使乙醇量達60%，醇沉24 h。棄上清液，沉淀干燥后得GAGs-2。GAGs-2置于4 ℃條件下保存備用。

1.3.4 溶液的配制

硫酸軟骨素鈉標準儲備液的配制：準確稱取標準樣品0.004 g，用1.4%復合酶酶解，4 ℃貯存備用。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

取硫酸軟骨素二糖儲備液于1 cm比色皿中，以0.1 mol/L Tris-HAc（pH 9.1）緩沖液為參比，掃描測定波長180～600 nm的紫外-可見吸收曲線，得到化合物的紫外-可見吸收光譜。硫酸軟骨素的最大吸收波長在228 nm處，因此本實驗選擇228 nm為硫酸軟骨素二糖的檢測波長。

2.2 花蛤中GAGs的液相色譜分析

花蛤中提取的GAGs酶解液的HPLC圖，如圖1所示，在實驗色譜條件下得以分離，經與標樣對比，確定峰3為硫酸軟骨素。

圖1 樣品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of GAGs extracted from hard clams

2.3 花蛤中GAGs質譜

硫酸軟骨素標準樣品ΔDi-4S、ΔDi-6S的質譜圖見圖2。圖1中峰1、2的質譜圖見圖3。

圖2 標準樣品ΔDi-4S（A）、ΔDi-6S（B）的質譜圖Fig.2 MS spectra of ΔDi-4S and ΔDi-6S standards

圖3 樣品酶解產物峰1（A）、2（B）的質譜圖Fig.3 MS spectra of peaks 1 and 2 of the enzymatic hydrolysate of hard clams

圖2 中硫酸軟骨素二糖電離后產生的分子離子峰，m/z 458是單硫酸二糖的準分子離子峰[M—H]—，ΔDi-4S（ΔGlcUA-[1→3]-GalNAc-4S）、ΔDi-6S（ΔGlcUA-[1→3]-GalNAc-6S）由于質量數均為459，因此難以通過準離子峰將其區分開來，其差別主要體現在碎片離子上。Begona等[19]對這2 種硫酸軟骨素二糖的質譜研究表明，ΔDi-4S的特征碎片峰表現為離子豐度m/z 300大于m/z 282或不存在m/z 282，而ΔDi-6S的特征碎片峰表現為離子豐度m/z 282大于m/z 300或不存在m/z 300。對于本實驗，ΔDi-4S和ΔDi-6S的質譜碎片峰同樣表現出以上特征。ΔDi-4S的質譜圖中m/z 300豐度較高但不含m/z 282，ΔDi-6S的質譜圖中m/z 282豐度較高，大于m/z 300。圖3A中僅出現m/z 300，而無m/z 282，正是ΔDi-4S特征的體現；而圖3B中僅出現m/z 282，而無m/z 300，體現出ΔDi-6S特征。結果表明，通過質譜分析可實現花蛤中GAGs的結構鑒定。

2.4 花蛤中GAGs紅外光譜分析

對花蛤GAGs提取物在500～4 000 cm—1波數范圍內掃描測試，其結構分析結果如圖4。在波數3 429 cm—1附近有強吸收，說明有多糖羥基（—OH）；在2 927cm—1波數處有吸收，說明有—CH3的C—H伸縮振動；在1 639cm—1附近有強吸收，說明有乙酰氨基（—NHCOCH3—）的存在；在波數1 418 cm—1附近有吸收，說明有羧基（—COO—）存在；在波數1 264 cm—1附近有吸收，說明有硫酸基（—O—SO3—）存在；在波數700.82 cm—1說明在氨基己糖上有硫酸酯鍵的連接。以上現象均說明該提取物具備硫酸軟骨素的基本特征[20-22]。花蛤GAGs的紅外光譜圖分析的官能團見表2。由圖4、表2分析可知，花蛤GAGs含有羥基、酰胺基、硫酸基、氨基。

圖4 花蛤提取物的紅外光譜測定Fig.4 IR spectrum of hard clam extract

表2 花蛤GAGs紅外光譜圖分析Table2 IR spectral analysis of GAGs extracted from hard clams

2.5 硫酸軟骨素的線性關系

用800 mg/L硫酸軟骨素標準溶液，依次稀釋為400、200、100、50 mg/L和25 mg/L，在選定的檢測條件下，分別由低質量濃度向高質量濃度進樣分析。以峰面積對應軟骨素質量濃度ρ（mg/L）作線性回歸，得回歸方程為ρ=0.23A＋0.39，相關系數為0.999 9；說明硫酸軟骨素在25～400 mg/L質量濃度范圍內，具有良好的線性關系。并由色譜峰面積計算可得ΔDi-4S的質量分數為3.5%，ΔDi-6S的質量分數為2.3%。

3 結 論

GAGs是生物組織中重要的活性大分子，通過酶解方法提取其有效成分，獲得GAGs種類、結構、性質等方面的信息[23]，對研究其生物學性質至關重要[24-25]。本研究采用UPLC-ESI-MS聯用技術對花蛤中GAGs類組分進行分離與結構鑒定，方法行之有效，利于批量樣品的快速分離與測定。

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Separation and Structure of Glycosaminoglycans from the Hard Clam Meretrix meretrix

LIN Jianyuan JIA Kangming LI Yao
(College of Biological and Environmental Sciences Zhejiang Wanli University Ningbo 315100′China)

Objective To extract glycosaminoglycans (GAGs from hard clams (Meretrix meretrix by multi-enzymatic hydrolysis and to analyze the structure of chondroitin sulfate in the extract by infrared (IR spectroscopy Methods The components of GAGs were examined by ultra high performance liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry (UPLC-ESI-MS using an ACQUITY UPLC BEH Amide chromatographic column (2.1 mm × 100 mm′1.7 ?m and an ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard guard column (2.1 mm × 5 mm′1.7 ?m). The mobile phase was composed of a mixture of water and methanol (75:25′V/V containing 0.2% glacial acetic acid at a flow rate of 0.1 mL/min The injection volume was set as 20 μL Results Rapid separation of the components was achieved and their structures were determined by UPLC-ESI-MS Conclusion This paper provides an effective method to identify the structure of GAGs.

hard clams glycosaminoglycans chondroitin sulfate ultra high performance liquid chromatographyelectrospray-mass spectrometry (UPLC-ESI-MS); infrared spectroscopy (IR)

S931

A

1002-6630（2015）06-0183-04

10.7506/spkx1002-6630-201506034

2014-08-07

浙江省科技廳分析測試項目（2012C37026）；浙江省現代微生物技術與應用重中之重學科資助項目（ZS2013010）

林建原（1965—），女，副教授，碩士，研究方向為天然產物提取及分析檢測。E-mail：linjianyuan33@163.com