4 ℃貯藏期內冷鮮羊肉表面菌相變化分析

周琰冰，艾啟俊′*，張德權*

（1.北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

4 ℃貯藏期內冷鮮羊肉表面菌相變化分析

周琰冰1，艾啟俊1′*，張德權2′*

（1.北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

研究4℃條件下貯藏時間對冷鮮羊肉表面菌相組成的影響，以菌落總數為指標，結合菌落聚合酶鏈式反應法，了解冷鮮羊肉在其貯藏期內的菌群構成，以及隨著貯藏時間延長其優勢菌群的變化。結果表明，冷鮮羊肉在4℃托盤貯藏條件下，菌落總數隨貯藏時間的延長而增加，第7天其菌落總數超過106CFU/g，樣品已經腐敗變質；其表面主要菌群包括假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬等。隨著貯藏時間的變化，假單胞菌占總菌相的大部分，是造成冷鮮羊肉腐敗變質的主要優勢菌。

冷鮮羊肉；菌落總數；菌落聚合酶鏈式反應；4 ℃冷藏；優勢菌

近年來，隨著經濟的飛速發展，我國肉品生產得到了快速提高，據國家統計局公布數據顯示，2013年我國肉類總產量8 535萬 t，比上年增長1.7%[1]。但是，畜體屠宰及加工過程中損失率高、品質較低、貨架期較短等問題一直阻礙著我國肉類產業的發展。

冷鮮肉是指將屠宰后的畜胴體進行冷卻處理后，其胴體溫度在24 h之內降至0～4 ℃，并在后續加工、運輸和銷售過程中一直保持此溫度的生鮮肉[2]。低溫能夠抑制大多數酶的活性和微生物的生長繁殖。基于冷鮮肉的各種優勢，國家明確指出，要在2015年使冷鮮肉占比提高到30%，可見冷鮮肉將是我國肉類行業發展的必然趨勢[3]。畜肉由于受到微生物和酶作用以及環境中溫度、氧氣、水分等條件的影響，很容易腐敗變質。肉品在一定條件下貯藏時，細菌的數目幾乎呈線性增加[4]。所以，細菌數目的變化可以作為判斷肉品被污染程度以及肉品衛生質量的評判標準之一。因此，冷鮮肉的保鮮要考慮到抑制表面微生物的生長繁殖以及氧化作用造成的肉品質降低。

羊肉在我國相當受歡迎，2013年我國羊肉產量達到408萬 t，增長2.0%[1]，不僅肉品鮮嫩，營養充足，易于消化，而且進食時不用考慮文化與宗教的禁忌[5]。但是，肉中的微生物來源廣泛，品種眾多，包含真菌、細菌、病毒等，可分為食物中毒性微生物、致病性微生物以及致腐性微生物三大類群及其他微生物[6]。傳統的微生物檢測大多以分離純化培養為基礎，再根據菌落形態及生理生化特征確定其類型，但此方法耗時較長，需要1～2 d的培養時間，并對單菌落進行各種生理指標測定來確定其種屬，因此，這種傳統的研究方法只能作為一種輔助手段，需要與其他方法結合起來才能客觀而全面反映微生物群落結構的真實信息。

在食品工業中，生物技術是一種得以讓人類生活質量發生進步的科學措施，通過利用生物流程生產細胞或其代謝物質來生產食物并改變以前的生產過程[7]。菌落聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種直接從培養基中獲得單個菌落，或者直接分析需要的DNA片段部分的方法[8]，它被應用于細菌、酵母、真菌的研究中[9-11]。與普通DNA的PCR不同在于菌落PCR的方法不提取基因組DNA，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，省時少力，可以快速鑒定菌落是否為含目的質粒的陽性菌落。操作簡單、快捷，陽性率較高，結果具有高度的特異性和敏感性，在轉化鑒定中較常見[12]，還經常用于基因擴增，分類篩選和診斷等實驗中[13]。

已有研究[14-16]利用選擇培養基的方法分離和鑒定冷鮮羊肉的菌相消長規律，但培養時間長，培養條件要求多，不能快速知曉冷鮮肉表面的菌相情況。而本研究則是以菌落總數為指標，判斷托盤包裝冷鮮羊肉在4 ℃條件下的貯藏期，并通過菌落PCR方法對冷鮮羊肉貯藏過程中表面微生物的多樣性進行研究，從而了解冷鮮羊肉在其貯藏期內的菌群構成，以及隨著貯藏時間延長其優勢菌群的菌相變化。與前人的方法相比較，菌落PCR節省了鑒定各種微生物生理生化指標的時間，通過返回的序列進行同源性比對，可以得知樣品表面的菌相構成并判斷其消長規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊前腿肉（當天屠宰）購自北京農學院便民超市，返回實驗室后將其迅速放入—20 ℃冰箱內1h，使其中心溫度降至4 ℃后，取出置于4 ℃冰箱保藏。

營養瓊脂、營養肉湯、NaCl（分析純）、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、冰醋酸 北京藍弋試劑有限公司；Primer Eu27F、1492R 生工生物工程（上海）股份有限公司；TaKaRa TaqTMPremix、DL2000、Andy Safe核酸染料 北京六合通經貿有限公司。

1.2 儀器與設備

YT-CJ-1ND型超凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發中心；TCYQ型全溫振蕩器 太倉市實驗設備廠；MLS-3780型全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；MyCycler Thermal Cycler型PCR儀、76S106783型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；TE212-L型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；BG-subMINI型迷你水平電泳儀 北京百晶生物技術有限公司；BCD-288WSL型冰箱 青島海爾股份有限公司；DHP-500型電熱恒溫培養箱 天津市中環實驗電爐有限公司；微波爐 廣東格蘭仕集團有限公司。

1.3 方法

利用傳統微生物培養法和菌落PCR技術進行冷鮮羊肉表面微生物種類的分析。

1.3.1 樣品準備

取出中心溫度已降至4 ℃的羊大腿肉，放置在無菌超凈臺內，用無菌刀除去其表面筋膜與脂肪，切成約10 g的肉塊，隨機挑選3 塊為一組樣品，放入無菌托盤內，用無菌保鮮膜包好后，置于4 ℃冰箱內備用。準備6 組樣品，每天測定冷鮮羊肉表面的菌落總數，直至其菌落總數超過國家規定數值。

1.3.2 菌落總數測定

按照GB 4789.2—2010《食品衛生微生物學檢驗：菌落總數測定》[17]進行測定。

取一份樣品置于無菌操作臺內，用無菌剪刀剪碎后置于帶濾網的無菌均質袋內，倒入90 mL 0.85%已滅菌的生理鹽水，均質機拍打1 min，制成1∶10的稀釋液，靜置5 min后，吸取上清液1 mL于裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管內，制成1∶100的樣品勻液，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。

平皿中倒入15 mL左右冷卻至50 ℃的營養瓊脂培養基，稍轉動培養皿后平放在超凈操作臺，待瓊脂凝固后，根據對樣品污染情況的估計，選擇2～3 個適宜稀釋度的樣品勻液，吸取100 μL稀釋液于培養基表面，用涂布棒涂勻，平板靜置10 min后于（36±1）℃恒溫培養箱內倒置培養48 h，記錄稀釋倍數和相應的菌落總數，選擇菌落數在30～300 CFU范圍內的平板進行計數后放于4 ℃冰箱內貯藏備用，平行實驗3 次。

1.3.3 菌懸液制備

選取菌落總數在30～300 CFU范圍內的平皿，菌落計數，用記號筆標記出每個可見單菌落的位置，劃分區域，用接種環依次挑取每個單菌落于裝有5 mL滅菌營養肉湯培養基的試管內，盡量保證所有數據采集完整，搖床37 ℃、160 r/min振蕩過夜。待菌懸液制備后，用移液槍從每支試管內吸取100 μL菌液，垂直滴落在已凝固的營養瓊脂培養基上，靜置10min左右，倒扣于（36±1） ℃的培養箱內培養24 h，進行保種，待單菌落生成后，將平板置于4 ℃冰箱內保藏備用，菌懸液置于冰箱內備用。

1.3.4 PCR擴增

采用細菌16S rDNA通用引物（Eu27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和（1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）進行PCR擴增。50 μL反應體系：Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，以上一步中已振蕩過夜培養并經過保種實驗后能夠成功得到單菌落的菌懸液作為模板，添加1 μL于反應體系中，補充ddH2O 22 μL至反應總體系為50 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，30 個循環；72 ℃延伸8 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度為1 500 bp左右，PCR反應原液置于4 ℃貯藏備用。

1.3.5 序列測序

PCR原液的測序工作由上海生工生物有限公司完成，測序后的拼接結果在NCBI上進行BLAST（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）相似序列檢索比對。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏時間條件下菌落總數變化

表1 不同貯藏時間對冷鮮羊肉表面菌落總數的影響Table1 Effects of storage time on the total number of colonies on chilled fresh muttttoonn

我國對于冷鮮肉的衛生標準尚無菌落總數指標，一般菌落總數參考評價標準為新鮮肉相關標準[18-19]。本實驗測定了不同貯藏時間后冷鮮羊肉表面的菌落總數，從表1可以看出，隨著貯藏時間延長，冷鮮羊肉表面的菌落總數呈上升趨勢，貯藏一段時間后樣品表面的菌落總數由最初的103CFU/g增加到了106CFU/g，根據參考標準規定，冷鮮肉細菌菌落總數不能超過1×106CFU/g，因此，冷鮮羊肉在4 ℃條件下貯藏時間一般不超過7 d。

2.2 PCR擴增結果

圖1 PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products

以菌懸液作為DNA模板，利用細菌通用引物27F和1492R進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得長度約1 500 bp的片段，結果見圖1。所有樣品均可見較明亮的擴增條帶，且陰性對照孔無條帶出現，說明操作過程方法可行，操作規范無污染，本實驗的PCR擴增條件是合適的。

2.3 貯藏期內冷鮮羊肉表面優勢菌組成分析及其變化規律

表2 不同貯藏時間條件下冷鮮羊肉單菌落個數Table2 Individual colony numbers of chilled fresh mutton as a function of storage ttiimmee

由表2可知，以每個單菌落制備菌懸液作為DNA模板進行的PCR擴增，實驗結果有部分損失，但整體送檢有效率能夠達到87%以上，實驗方法操作可行。

表3 貯藏期內冷鮮羊肉表面優勢菌組成比例Table3 The composition of dominant bacteria on chilled fresh mutton as a function of storage ttiimmee%

分析貯藏期冷鮮羊肉各種細菌占總菌數的百分比，通過表3分析測序結果可以看出，冷鮮羊肉貯藏初期，微生物種類較多，其中，假單胞菌、芽孢桿菌和不動桿菌所占比例較大，隨著貯藏時間的延長，冷鮮羊肉表面的優勢菌有了明顯的變化，到了貯藏第3天，假單胞菌所占比例較前2 d有了大幅增加，而初始比例較大的芽孢桿菌和不動桿菌的占比卻有所下降；當達到貯藏第7天時，送檢樣品只檢測出兩種細菌，而假單胞菌更是占送檢樣品結果的98%，所占比例占明顯優勢，成為冷鮮羊肉表面的絕對優勢菌群。

由此可以看出，冷鮮羊肉表面初始微生物包括假單胞菌、不動桿菌、芽孢桿菌以及檢測到的球菌、桿菌等微生物，而在貯藏后期，優勢菌群主要為假單胞菌，隨著貯藏時間的延長，嗜冷桿菌的數量也呈小幅增加趨勢，氣單胞菌在貯藏后期也可檢出，但最主要的菌群是假單胞菌，是造成托盤包裝的冷鮮羊肉腐敗的主要微生物。

3 結論與討論

以單菌落的菌懸液作為DNA模板，利用細菌通用引物進行PCR擴增，產物經電泳檢測后可以獲得約1 500 bp的片段長度，操作過程方法可行，相比于傳統的微生物分離鑒定方法判斷樣品菌落的變化規律，本實驗能夠節省鑒定單菌落各生理生化指標的時間，一定程度上減少實驗員的工作量。

托盤包裝冷鮮羊肉中的初始微生物主要包括了假單胞菌、芽孢桿菌、不動桿菌、嗜冷桿菌、氣單胞菌屬等微生物，其中，假單胞菌、芽孢桿菌和不動桿菌屬在冷鮮羊肉貯藏初期占據優勢地位，隨著時間的延長，假單胞菌的增長速率加快，貯藏后期，它在數量上占有絕對優勢，是引起冷鮮羊肉腐敗的主要微生物，這與已有研究[20]指出的常存在于胴體和分割肉表面的微生物主要為假單胞菌、不動桿菌、氣單胞菌屬等嗜冷菌的結論一致。

采用菌落計數法測定冷鮮羊肉表面菌落總數，參考GB 5009.44—2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》[19]：新鮮肉為104CFU/g以下、次鮮肉為104～106CFU/g、變質肉為106CFU/g以上。樣品冷鮮羊肉在第7天的菌落總數超過106CFU/g，根據標準已腐敗變質，不可再食用。在4℃條件下，冷鮮羊肉貯藏時間不超過7 d。

本實驗通過菌落計數與菌落PCR法，可以有效判斷貯藏期間冷鮮羊肉表面菌相的變化。樣品在低溫貯藏初期保持了一定的新鮮度，說明低溫環境和保鮮膜包裝可在一定程度上抑制微生物的生長繁殖，從而延緩羊肉腐敗變質速率，在第0天時樣品表面細菌種類多，所占比例相對平均，而到第7天時，細菌種類只剩下2 種，并且假單胞菌所占比例極大。這表明在對羊肉進行保鮮的過程中，不僅要利用合理的保鮮方法，還要找到抑制假單胞菌的有效方法。

大部分微生物，如致病菌和嗜溫菌，在冷藏條件下其生長因溫度因素影響而受到抑制，但4 ℃冷藏條件不能完全抑制嗜冷菌的生長繁殖。假單胞菌是一類革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中，在冷藏溫度條件下可以快速生長，大部分報道指出，假單胞菌在低溫有氧貯藏條件下具有很高的生長率，決定了冷鮮肉的貨架期[21-24]，當溫度是唯一或者主要的限制因素時，假單胞菌在冷藏食品中的生長速率比其他污染細菌的生長速率快30%[25]。本研究結果也證實了這一結論，所以在使用各種保鮮技術對羊肉進行保鮮時，還應該特別找出抑制假單胞菌的方法，這樣才能更好的保持冷鮮羊肉的品質，以延長保質期。

為此，后續實驗應加強對假單胞菌一些特性反應的研究，尋求一種定性定量的快速方法，能夠判斷冷鮮肉表面假單胞菌的含量，從而快速判斷肉品的新鮮度。此外實驗送樣測序的返回率未達到100%，證明實驗中存在著數據的損失，這和人為實驗操作有密不可分的關系，后續實驗需要加強對這方面干擾的控制。

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Changes in Microflora on Fresh Mutton during Chilled Storage

ZHOU Yanbing1′AI Qijun1′*′ZHANG Dequan2′*

(1. College of Food Science and Engineering Beijing University of Agriculture Beijing 102206′China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100193′China)

The composition of the bacterial microflora on fresh mutton as a function of storage time at 4 ℃ was determined by total plate count and colony polymerase chain reaction (PCR). The results showed that the total number of colonies on tray-packaged mutton increased with an increase in storage time and exceeded 106CFU/g at the seventh day indicating spoilage of the mutton The main bacteria were Pseudomonas′ Bacillus Acinetobacter and etc During storage Pseudomonas became the dominant spoilage bacterium in chilled meat.

chilled fresh mutton total number of colonies colony PCR refrigeration at 4 ℃; dominant bacteria

TS201.3

A

1002-6630（2015）06-0242-04

10.7506/spkx1002-6630-201506046

2014-06-24

公益性行業（農業）科研專項（201303083）

周琰冰（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品質量與安全控制。E-mail：starella@aliyun.com

*通信作者：艾啟俊（1954—），男，教授，碩士，研究方向為食品安全、農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制。E-mail：aiqj@sohu.com張德權（1972—），男，研究員，博士，研究方向為肉品加工與安全。E-mail：dqzhang0118@126.com