氣相色譜-質譜聯用法檢測香菇中香菇素的含量

周佳欣，白 冰，周昌艷*，邵 毅

（上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403）

氣相色譜-質譜聯用法檢測香菇中香菇素的含量

周佳欣，白 冰，周昌艷*，邵 毅

（上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403）

建立測定香菇中香菇素的氣相色譜-質譜聯用檢測方法。以乙腈提取樣品，Florisil柱凈化，使用氣相色譜-質譜儀以選擇離子監測模式進行分析測定。在設定色譜條件下，香菇素在1.0～20.0 μg/mL范圍內線性良好；添加10.0、20.0、30.0 mg/kg香菇素溶液的平均回收率在86.61%～98.48%之間，相對標準偏差在2.92%～4.28%之間，檢出限為0.10 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg。本方法操作方便、重復性良好，為香菇中香菇素的定性和定量檢測提供可靠的分析方法。

固相萃取；氣相色譜-質譜法；香菇素

香菇不僅具有較高的營養和保健價值，還具有獨特的風味，深受消費者青睞[1-2]。已經證實香菇鮮美之味主要來源于其核酸分解酶催化底物核酸生成的核苷酸物質[3-5]，而香菇的風味取決于其中含有的揮發性芳香物質[6]。含硫化合物通常能影響菇體整體的芳香，是香菇中最重要的香味來源[7-11]。香菇素化學名稱為l,2,3,5,6-五硫雜環庚烷，是一種具有強烈的香菇特征風味的含硫雜環化合物，是由前體物質香菇酸在谷氨酸轉肽酶的作用下產生二硫雜環丙烷中間體聚合而成的[10,12]，1966年被發現并命名為香菇素、香菇精[13-14]。化學結構式見圖1。

圖1 香菇素化學結構式Fig.1 Chemical structure of 1′2′3′5′6-pentathiepane

作為香菇中揮發性風味物質的重要成分之一，香菇素的檢測技術研究受到廣泛關注。國內外已有學者運用水蒸氣蒸餾法[15]、溶劑萃取法、同時蒸餾萃取法[16]、固相微萃取法[17]、超臨界萃取法[18]對香氣成分進行萃取，并應用色譜、質譜及嗅聞技術對香菇的特征風味作了研究，鑒定了組成香菇特征風味的化合物[19-24]。但對于香菇素的定性、定量檢測，國內外并沒有檢測標準。本實驗對香菇中香菇素的含量檢測方法進行研究，以香菇鮮樣和香菇干樣為研究對象，運用固相萃取、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術對香菇的特征風味物質進行定性和定量分析測定，旨在確定一種香菇中香菇素的檢測分析方法，為香菇質量評價、風味改良、蘑菇風味料開發提供技術參數和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗用鮮香菇和干香菇由上海市周邊地區某食用菌生產基地提供。鮮樣：分取約500 g，切碎，用組織搗碎機勻漿后，置于密閉容器中。干樣：分取約200 g，機械粉碎，過380 μm篩，混勻置于密閉容器中。

乙腈、正己烷、丙酮（均為色譜純） 上海安譜科學儀器有限公司；弗羅里硅土柱（Florisil：3 mL，500 mg） 美國Agilent公司；香菇素標準品 中國Langchem公司。香菇素標準品用丙酮配制成質量濃度1 000 μg/mL標準儲備溶液，梯度稀釋為1、2、5、10、20 μg/mL的標準工作液。

1.2 儀器與設備

6890-5975C氣相色譜-質譜聯用儀（帶有分流/不分流進樣口及電子電離源） 美國Agilent公司； HR2096組織搗碎機 荷蘭Philips公司；HY-5回旋式振蕩器常州翔天實驗儀器廠；Visiprer DL固相萃取裝置 美國Supelco公司；QGC-361氮吹儀 上海泉島公司。

1.3 方法

1.3.1 提取

稱取香菇鮮樣5.00 g，香菇干樣0.50 g需加入4.5 mL水混勻，準確加入10 mL乙腈，在回旋振蕩器上以150 r/min轉速振搖45 min后過濾，將濾液收集至加入4 g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈振蕩1 min，靜置15 min以上待分層。吸取2 mL上層有機相于燒杯中，50 ℃氮吹至近干，加入2 mL正己烷溶液溶解，待凈化。

1.3.2 凈化

參考NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》的凈化方法并優化[25]，將Florisil柱用3 mL正己烷-丙酮（9∶1，V/V）溶液、2 mL正己烷溶液依次淋洗，當溶劑液面到達吸附層表面時，立即倒入上述待凈化溶液，用試管接收洗脫液，用3 mL正己烷-丙酮溶液重復沖洗2 次，將裝有洗脫液的試管置于氮吹儀上，50 ℃氮吹至近干，用2 mL正己烷溶液定容，在旋渦混合器上混勻，移入進樣瓶中，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HP-5MS毛細柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫至280 ℃保持5 min，后運行1 min；載氣（He）流速1.0mL/min；進樣量1.0 μL；不分流進樣。

1.3.4 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度220 ℃；質量掃描范圍m/z 50～550；選擇離子監測（selected ion monitoring，SIM）方式。

2 結果與分析

2.1 質譜分析條件的優化

圖2 GC-MS 全掃描（A）、SIM（B）模式檢測香菇素總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of 1′2′3′5′6-pentathiepane standard

圖3 鮮香菇（A）、干香菇（B）的GC-MS選擇離子檢測圖Fig.3 GC-MS total ion chromatograms of 1′2′3′5′6-pentathiepane in fresh and dry Lentinula edodes

用弱極性HP-5MS毛細管柱，采用全掃描方式在m/z 50～550范圍內分析香菇素標準溶液，然后根據保留時間和質譜圖，確定其在SIM測定方式中的結束采集時間和監測離子。采用全掃描方式得到香菇素含量為1.0 mg/kg的總離子流圖，如圖2A所示，出峰時間為15.305 min。根據全掃描模式條件下的離子碎片豐度，選擇m/z 142作為香菇素的定量離子，選擇m/z 78、124、188作為香菇素的定性離子。以SIM模式得到香菇素含量為1.0 mg/kg的總離子流圖，如圖2B所示。以SIM模式檢測干香菇和鮮香菇的樣品，分別得到樣品的選擇離子掃描圖，如圖3所示。可以看到，在本實驗條件下，香菇素得到了很好地分離，沒有受到干擾，符合檢測的方法要求。

2.2 標準曲線、檢出限和定量限

根據香菇素在日常檢測中的含量范圍，建立標準曲線。配制標準溶液質量濃度分別為1、2、5、10、20 μg/mL，其線性方程如圖4所示。結果表明，香菇素在1～20 μg/mL范圍內，具有良好的線性關系，相關系數為0.992 8。

圖4 香菇素質量濃度1～20 120μg/mL范圍標準曲線Fig.4 Standard curve of 1′2′3′5′6-pentathiepane

從測定標準溶液（RSN＜20）的質量濃度得到的色譜圖中，以3 倍信噪比（RSN=3）為檢出限，以10 倍以上信噪比（RSN≥10）為定量限，計算得到香菇素的檢出限為0.10 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg。將實際樣品稀釋至該質量濃度進行相應的計算，結果顯示，香菇素質量濃度為0.10 μg/mL時，可以完全響應，香菇素質量濃度為0.25 μg/mL時，可準確計算其含量。

2.3 方法的準確度

選取香菇鮮樣、香菇干樣作為空白基質做添加回收實驗，在10.0、20.0 mg/kg和30.0 mg/kg 3 個水平進行添加回收實驗（n=3）。結果如表1所示，香菇素的平均回收率在86.61%～98.48%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在2.92%～4.28%之間，證實該方法的準確度較高，滿足測定要求。

表1 香菇鮮樣、香菇干樣的加標回收率和RRSSDDTable1 Spiked recovery and RSD of 1′2′3′5′6-pentathiepane in fresh and ddrryy Lentinula edooddeess

2.4 方法的精密度

選取香菇鮮樣、香菇干樣作為樣品，按照上述方法分別平行測定5 次，求平均值和RSD，RSD分別為4.13%和3.60%，結果表明該方法精密度較高（表2）。

表2 香菇鮮樣、香菇干樣的香菇素精密度實驗結果Table2 Precision (expressed as RSD of the method for replicate determinations of fresh andd ddrryy Lentinula edodes

3 結 論

本實驗針對香菇中香菇素建立一種固相萃取、GC-MS-SIM檢測方法。利用乙腈良好的提取能力，Florisil層析柱的凈化效果，達到了操作簡單、處理快速、節省溶劑的目的。在GC-MS-SIM模式下，方法檢出限為0.10 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg，添加10.0、20.0、30.0 mg/kg 3 個水平條件下的平均回收率在86.61%～98.48%之間，RSD在2.92%～4.28%之間。采用固相萃取進行樣品的前處理方 法耗時短、選擇性好、基質干擾小，而GC-MS-SIM方法準確度和精密度高，滿足了檢測的要求。

[1] 陶名熏. 香菇的藥效和食品開發[J]. 食品科學, 1986, 7(1): 11-13.

[2] 溫泉, 王錫昌. 食用菌風味物質的研究及應用進展[J]. 長江大學學報: 自然科學版, 2006, 3(4): 211-212.

[3] 陳明, 姜曉劍, 王偉中, 等. 香菇蒜蓉醬的研制[J]. 食用菌, 2002(4): 38-39.

[4] MAU J L. The umami taste of edible and medicinal mushrooms[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms, 2005, 7(1/2): 119-126.

[5] 吳迪, 谷鎮, 周帥, 等. 不同干燥技術對香菇和杏鮑菇風味成分的影響[J]. 食品工業科技, 2013, 34(22): 188-191.

[6] 余雄濤, 潘鴻輝, 謝意珍. 食用菌風味物質的研究及應用進展[J]. 中國食用菌, 2013, 32(3): 4-7.

[7] 程玉, 孫進, 葉興乾, 等. 食用菌風味物質研究進展[J]. 食品工業科技, 2012, 33(10): 412-414.

[8] KALAC P. Chemical composition and nutritional value of European species of wild growing mushrooms: a review[J]. Food Chemistry, 2009, 113(1): 9-16.

[9] 楊銘鐸, 龍志芳, 李建. 香菇風味成分的研究[J]. 食品科學, 2006, 27(5): 223-226.

[10] 鄭建仙. 福建香菇風味物質的分離與鑒定[J]. 中國食用菌, 1995, 14(6): 3-6.

[11] 楊開, 孫培龍, 宋力, 等. 香菇精的提取與成分分析[J]. 中國調味品, 2005, 30(6): 24-28.

[12] 安晶晶, 王成濤, 劉國榮, 等. 鮮香菇與干香菇揮發性風味成分的GC-MS分析[J]. 食品工業科技, 2012, 33(14): 68-71.

[13] 谷鎮. 食用菌呈香呈味物質分析及制備工藝研究[D]. 上海: 上海師范大學, 2012.

[14] CHEN C C, HO C T. Identifi cation of sulfurous compounds of shiitake mushroom (Lentinus edodes Sing.)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1986, 34(5): 830-833.

[15] 張郁松, 韓建軍. 水蒸氣蒸餾法提取大蒜油的工藝研究[J]. 中國調味品, 2011, 36(3): 27-29.

[16] LIKENS S T, NICKERSON G B. Gas chromatographic evidence for the occurrence of the hop oil components in beer[J]. Journal of Chromatography, 1966, 21: 1-5.

[17] 宋國新, 余應新, 王林祥, 等. 香氣分析技術與實例[M]. 北京: 化學工業出版社, 2008: 146-164.

[18] 潘見, 楊克, 張文成, 等. 超臨界萃取CO2萃取天然產物技術及發展[J].精細與專用化學品, 2001(14): 14-16.

[19] 劉楊岷, 王林祥, 袁申淑, 等. 中國香菇風味成分的分離與鑒定[J].質譜學報, 1990, 13(1): 31-35.

[20] 溫泉. 香菇揮發性風味物質研究[D]. 上海: 上海水產大學, 2007.

[21] MASAKAZU H, TADAKAZU N, TAKESHI F. The smell and odorous components of dried shiitake mushroom, Lentinula edodes Ⅵ: increase in odorous compounds of dried shiitake mushroom cultivated on bed logs[J]. Journal of Wood Science, 2010, 56(6): 483-487.

[22] 張書香, 謝建春, 孫寶國. 固相微萃取/氣-質聯用分析香菇揮發性香味成分[J]. 北京工商大學學報: 自然科學版, 2010, 28(2): 1-5.

[23] GARDNER J W, BARTLETT N. A brief history of electronic nose[J]. Sensors and Actuators B, 1994, 18(1/2/3): 201-211.

[24] 唐向陽, 張勇, 丁銳, 等. 電子鼻技術的發展及展望[J]. 機電一體化, 2006(4): 11-15.

[25] 劉瀟威, 買光熙, 李凌云, 等. NY/T 761—2008 蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定[S].北京: 中國農業出版社, 2008.

Determination of 1′2′3′5′6-Pentathiepane in Lentinula edodes by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHOU Jiaxin BAI Bing ZHOU Changyan*′SHAO Yi
(Institute for Agri-Food Standards and Testing Technology Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai 201403′China)

A simple and rapid method was developed for determining 1,2,3,5,6-pentathiepane in Lentinula edodes by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Samples were extracted by acetonitrile, purifi ed by solid-phase fl orisil column and detected by GC-MS under selective ion monitoring mode. Good linear correlation was obtained within the concentration range of 1,2,3,5,6-pentathiepane between 1.0 and 20.0 μg/mL, under the chromatographic conditions used in this study. The average recovery rates of 1,2,3,5,6-pentathiepane at spiked concentrations of 10.0, 20.0 and 30.0 mg/kg were between 86.61% and 98.48%, with relative standard deviation of 2.92%?4.28%. The detection limit and quantifi cation limit were 0.10 and 0.25 mg/kg, respectively. This method has the advantages of convenient operation and good reproducibility, which is suitable for determining 1,2,3,5,6-pentathiepane in Lentinula edodes.

solid-phase extraction; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); 1,2,3,5,6-pentathiepane

O657

A

1002-6630（2015）06-0151-04

10.7506/spkx1002-6630-201506028

2014-07-08

2014年國家食用菌質量安全風險評估項目（GJFP2014005）；上海市市級農口系統青年人才成長計劃課題（滬農青字（2014）第1-7號）

周佳欣（1982—），女，助理研究員，博士，研究方向為農產品中農藥殘留分析、食用菌風味物質。E-mail：zhou_jx@126.com

*通信作者：周昌艷（1969—），女，研究員，博士，研究方向為食用菌中農藥殘留檢測技術。E-mail：changyanz@sina.com