響應面法優化假絲酵母Y6產γ-氨基丁酸發酵工藝

鄭鴻雁，趙煒彤，昌妍希

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010100）

響應面法優化假絲酵母Y6產γ-氨基丁酸發酵工藝

鄭鴻雁1，趙煒彤1，昌妍希2

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010100）

從火龍果果實表面上篩選出一株發酵產γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）假絲酵母菌菌株Y6（Candida sp.）。用反相高效液相色譜測定發酵液中GABA含量。響應面試驗確定其最適培養基成分為：蔗糖23 g/L、麩皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L。最適培養條件為初始 pH 4.5、培養溫度28 ℃、轉速200 r/min、培養時間3.5 d。結果表明：優化之后GABA的產量提高了72%。

γ-氨基丁酸；假絲酵母；響應面法；培養基成分

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又稱氨酪酸，是一種非蛋白質組成的天然氨基酸，分布非常廣泛[1]，在動物[2]、植物和微生物中均有γ-氨基丁酸存在[3-6]。GABA是哺乳動物中樞神經系統一種主要的抑制性神經遞質[7]，具有許多重要的生理功能，如降血壓[8]、安定神經[9]、增強記憶[10]、抗焦慮[11]，尤其對更年期的失眠、壓抑和自身失調療效良好[12]。隨著GABA的生理功能不斷研究和闡明[13]，已經發展成為一種新型的功能性因子[14]，正逐漸應用于醫藥、食品及農業等行業中[15-17]。目前GABA主要通過微生物發酵方法進行生產[18]，大腸桿菌是發現較早的具有谷氨酸脫羧酶活性的微生物，利用大腸桿菌發酵法制備的GABA一般用于化工生產，很少用于食品工業，因此制約了GABA的生產和開發[19]。本研究以篩選自火龍果果實表面的假絲酵母菌株Y6為研究對象，通過單因素試驗和響應面法對其產GABA進行發酵工藝條件優化，提高GABA產量。用麩皮作為發酵培養基中的氮源，為規模化利用廉價農副產品生產保健品奠定了基礎，對于GABA的發酵生產具有參考意義。總之，國內學者的研究工作主要集中在篩選高產GABA的菌株上，但是其規模化生產的成本太高，因此降低γ-氨基丁酸的發酵培養成本是限制我國生產γ-氨基丁酸的瓶頸問題，突破該瓶頸勢在必行。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基與試劑

假絲酵母（Candida sp.）Y6：分離自火龍果果實表面，購于長春市歐亞超市。菌種經生工生物工程（上海）股份有限公司分子生物學鑒定。

基礎發酵培養基：葡萄糖30 g、麩皮40 g、L-谷氨酸5 g、磷酸吡哆醛0.12 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL。

γ-氨基丁酸標準品 上海楷洋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Z-36HK高速低溫冷凍離心機 德國Hermle公司；DL-CJ-2N超級潔凈工作臺、空氣浴振蕩箱 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（SPD-20A紫外檢測器，LC-20AT泵，CTO-10AS VP柱溫箱，LC-solution工作站） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株Y6發酵基礎培養條件

按2%的接種量接種在裝有100 mL無菌發酵培養基（初始pH 6.0）的250 mL三角瓶中，26 ℃、200 r/min條件下恒溫旋轉培養2.0 d。

1.3.2 GABA含量的測定

用鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）柱前衍生紫外檢測反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法測定發酵液中GABA含量。液相色譜條件：色譜柱：Venusil-AA氨基酸分析專用柱（5 μm）。流動相：流動相A為25 mmol/L的乙酸鈉，用4%的乙酸調pH值至5.9；流動相B為純乙腈。流速為1 mL/min，梯度洗脫程序如表1所示，柱溫40 ℃，進樣量20 μL，檢測波長：332 nm。取發酵液5 000 r/min離心15 min取上清液，稀釋到一定濃度。發酵液20 μL于樣品瓶中，加入OPA衍生液100 μL，渦旋振蕩5 s，靜置2 min后，過0.45 μm濾膜，取20 μL進樣。定量采用GABA標準曲線，取0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL GABA標準溶液分別鄰苯二甲醛衍生后進行液相色譜測定。以色譜圖中峰面積為縱坐標，以待測樣品質量濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為y=8.9×107x＋1 155.9（R2=0.999 8）。采用RP-HPLC檢測GABA所得的峰面積，根據標準曲線換算成GABA產量。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program

1.3.3 發酵培養基優化

1.3.3.1 單因素試驗

選擇不同碳源、碳源質量濃度、麩皮添加量、L-谷氨酸和磷酸吡哆醛作為影響假絲酵母Y6產GABA發酵培養基的主要因素。不同碳源種類有葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖（30 g/L)，選取最適碳源進行發酵試驗。各因素的水平梯度設置分別為最適碳源質量濃度15、20、25、30、35 g/L，麩皮添加量40、50、65、70、80 g/L，L-谷氨酸3、4、5、6、7、8、9 g/L，磷酸吡哆醛0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L。

1.3.3.2 響應面法優化培養基

根據單因素試驗結果，選取蔗糖質量濃度、麩皮添加量、L-谷氨酸添加量、磷酸吡哆醛添加量4 個因素為自變量，單因素試驗得出的各最佳條件為中心點，以GABA為響應值，進行響應面試驗設計，確定發酵培養基最優培養基組分含量。每個試驗重復3 次，取其平均值。

1.3.4 發酵條件優化

1.3.4.1 單因素試驗

選擇初始pH值、培養溫度、搖床轉速、培養時間作為影響假絲酵母Y6產GABA發酵條件的主要因素，通過單因素試驗結果選取響應面試驗的因素和水平。各因素的水平梯度設置分別為時間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 d，溫度22、24、26、28、30、32、34 ℃，初始pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，搖床轉速120、140、160、180、200、220 r/min。

1.3.4.2 響應面法優化培養條件

根據單因素試驗結果，選取初始pH值、培養溫度、搖床轉速、培養時間4 個因素為自變量，單因素試驗得出的各最佳條件為中心點，以GABA為響應值，進行響應面試驗設計，確定最優發酵條件。每個試驗重復3 次，取其平均值。

1.3.5 模型驗證

通過響應面法優化假絲酵母菌Y6產GABA發酵條件進行發酵試驗，比較模型預測值和試驗值，驗證模型的有效性。

1.4 數據分析

采用Design Expert 7.0軟件設計四因素三水平響應面分析試驗，試驗結果采用Design Expert 7.0軟件進行數據處理和分析，確定最佳試驗條件。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的確定

2.1.1 培養基單因素試驗結果

圖1 培養基對GABA產量的影響Fig.1 Effect of medium components on GABA production

由圖1a可知，不同的碳源種類對GABA產量有差異，以蔗糖作為發酵培養基碳源時，GABA產量明顯高于其他碳源，所以把蔗糖選作最適碳源。在確定碳源種類的基礎上，進一步確定蔗糖質量濃度大小，由圖1b可知，隨著蔗糖質量濃度的增大，GABA產量增加，當蔗糖質量濃度為25 g/L時，GABA產量達到最大。但隨著蔗糖質量濃度繼續增大，GABA產量降低，分析原因有可能是碳源質量濃度過大，會使菌體大量繁殖，影響GABA的積累。L-谷氨酸脫羧后生成GABA，可作為其前體物，由圖1c可知，隨著L-谷氨酸的增加，GABA產量迅速增大，當L-谷氨酸質量濃度為6 g/L時，GABA產量達到3.100 g/L，但繼續增加L-谷氨酸，GABA產量沒有明顯增大，可能是因為L-谷氨酸轉化率已經達到最大。麩皮是廉價農副產品，把它作為培養基的氮源，可以降低成產成本，增大麩皮的利用價值，由圖1d可知，隨著麩皮添加量的增大，GABA產量增加，麩皮添加量在60 g/L時，GABA產量最高，在麩皮超過60 g/L時，GABA產量略有降低，磷酸吡哆醛是谷氨酸脫羧酶的輔酶，在發酵培養基加入它有促進谷氨酸脫羧酶的作用，由圖1e可知，磷酸吡哆醛的最佳濃度為0.5 mmol/L。

2.1.2 培養基響應面優化

表2 發酵培養基響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface central composite design and experimental results for the optimization of medium components

表3 發酵培養基回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model for medium components

由方差分析得出P值，模型極顯著，模型的失擬項不顯著，回歸決定系數R2=0.950 4，修正決定系數= 0.900 7，說明方程擬合性較好，可以應用于對培養基優化的分析預測。根據結果進行分析：一次項X1、X4顯著，X2極顯著，二次項極顯著，交叉項X1X2顯著，X1X4、X2X3極顯著。由表3可知，影響GABA產量的因素大小排序依次是麩皮質量濃度、蔗糖質量濃度、磷酸吡哆醛濃度、L-谷氨酸質量濃度。

圖2 培養基交互因素響應面圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of medium components on GABA production

發酵培養基交互因素響應面立體分析見圖2。數據分析表明回歸模型存在最大值，發酵培養基最優配方為：蔗糖23 g/L、麩皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L，此條件下理論預測最大值為3.453 g/L。驗證實驗此條件下GABA產量為3.450 g/L，基本與預測值一致，證明了模型的可靠性。

2.2 發酵培養最適條件的確定

2.2.1 發酵條件單因素試驗結果

圖3 發酵培養條件對GABA產量的影響Fig.3 Effect of fermentation conditions on GABA production

由圖3a可知，發酵培養基初始pH值在4.0～5.0的范圍內，GABA產量在增大，當pH值大于5.0時，GABA產量明顯下降，表明培養假絲酵母Y6的最適pH值在5.0附近。由圖3b可知，溫度為28 ℃，GABA產量最高，低于或高于28 ℃，都不利于菌株產GABA，說明28 ℃左右是假絲酵母Y6產GABA較為適宜的溫度。由圖3c可知，搖床轉速從120 r/min增加到200 r/min的過程中，GABA產量不斷增大，在轉速高達220 r/min時，GABA產量略有降低。由圖3d可知，在發酵時間為2.0 d時，GABA產量為2.500 g/L，隨著發酵時間的延長，GABA產量逐漸增加。發酵時間在3.5 d時達最高，為4.100 g/L。但多于3.5 d時，GABA產量略有減少，選擇3.5 d為發酵培養時間。

2.2.2 發酵條件響應面優化

表4 發酵條件響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface central composite design and experimental results for the optimization of fermentation conditions

表5 發酵條件回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model for fermentation conditions

試驗方案及試驗結果見表4，回歸分析見表5。根據試驗結果，利用響應面分析軟件對數據進行分析，以GABA產量為響應值，得到回歸方程表達為：

由方差分析得出P值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數R2=0.955 9，修正決定系數說明方程擬合性較好，可以應用于對發酵條件優化的分析預測。根據結果進行分析：一次項X1極顯著，二次項極顯著，交叉項極顯著。由表5可知，影響GABA產量的因素由大到小排序依次是初始pH值、培養溫度、搖床轉速、培養時間。

圖4 發酵條件交互因素響應面圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of fermentation conditions on GABA production

發酵條件交互因素響應面立體分析見圖4。數據分析表明回歸模型存在最大值，發酵最優條件為：初始pH 4.5、培養溫度28 ℃、轉速200 r/min、培養時間3.5 d，此條件下理論預測最大值為4.333 g/L。進行驗證實驗，此條件下GABA產量為4.300 g/L，基本與預測值一致。

與采用其他氮源發酵生產GABA相比，利用麩皮作為氮源突破發酵成本高的缺陷，降低其生產成本，增加麩皮及農副產品的附加值，實現農副產品環境友好的高附加值轉化，在實際應用中具有更加廣闊的發展空間。除酵母菌外，含有谷氨酸脫羧酶的大腸桿菌、霉菌、乳酸菌等也可用于GABA的生產[20]。羅少華等[21]以明膠為載體，戊二醛為交聯劑，采用包埋-交聯復合固載法固定大腸桿菌細胞用于制備γ-氨基丁酸，雖然具有較高的轉化率，但安全性較差。邊鑫等[22]利用突變株米曲霉3.800接入大豆-水的培養基中發酵產GABA為0.874 g/L。江南大學黃桂東等[23]從黃酒發酵過程中分離得到的一株具有產GABA能力的植物乳桿菌MJ0301進行了發酵培養基的優化，產量為1.590 g/L。本實驗在發酵培養基中添加了輔酶磷酸吡哆醛，并且通過響應面優化了發酵培養基組分及發酵條件，有效地提高了發酵GABA的產量，最終GABA產量高達4.300 g/L。

3 結 論

本研究通過單因素試驗和響應面試驗方法，以GABA產量為指標，采用反相高效液相色譜鄰苯二甲醛柱前衍生法對發酵液中GABA含量進行測定，優化了假絲酵母菌Y6產GABA發酵培養基及其發酵條件。確定了假絲酵母Y6發酵產GABA的最優培養基配方：蔗糖23 g/L、麩皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L，最適發酵條件：初始 pH 4.5、培養溫度28 ℃、轉速200 r/min、培養時間3.5 d。在此條件下，GABA產量達4.300 g/L，較優化之前的2.500 g/L提高了72%。用響應面法優化假絲酵母Y6產GABA的發酵工藝條件是有效可行的。然而產量提高與多種因素有關，除了對菌種發酵條件的優化以外，利用現代分子生物技術改變GAD的酶活性來提高產γ-氨基丁酸的產量有待進一步研究。

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Optimization of Medium Components and Culture Conditions for Enhanced Yield of γ-Aminobutyric Acid by Candida sp. Y6 by Response Surface Methodology

ZHENG Hongyan1， ZHAO Weitong1， CHANG Yanxi2
(1. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Pharmacy College， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010100， China)

In this study， we optimized medium components and culture conditions of Candida sp. Y6， a γ-aminobutyric acid (GABA)-producing strain isolated from the surface of pitaya， using response surface methodology (RSM). The content of GABA in fermentation broth was analyzed by reversed phase high performance chromatography (RP-HPLC). The optimal fermentation medium was found to consist of 23 g/L sucrose， 65 g/L wheat bran， 6 g/L L-glutamate， and 0.5 mmol/L pyridoxal phosphate， and the optimal culture conditions were initial medium pH 4.5 and 28 ℃ for 3.5 d with a shaking speed of 200 r/min. Under the optimal conditions， the yield of GABA was increased 72% when compared with that before optimization.

γ-aminobutyric acid; Candida sp.; response surface methodology; medium components

TS201.3

A

1002-6630（2015）09-0130-06

10.7506/spkx1002-6630-201509024

2014-07-29

鄭鴻雁（1968—），女，副教授，碩士，研究方向為功能食品、微生物菌種篩選及發酵工藝。E-mail：zhenghongyan6811@163.com