白藜蘆醇對HaCaT細胞ABCA12蛋白表達的影響

李 軍 陳謹萍 吳 伽

·論著·

白藜蘆醇對HaCaT細胞ABCA12蛋白表達的影響

李 軍 陳謹萍 吳 伽

目的: 確定白藜蘆醇對角質形成細胞ABCA12表達的影響。方法: DMEM培養基培養HaCaT細胞，分別設空白組、白藜蘆醇處理組和過氧化氫處理組、聯合處理組。流式細胞儀檢測細胞內活性氧(ROS)水平，Real－time PCR檢測ABCA12 mRNA的表達，Western blot檢測ABCA12蛋白的表達。結果: 空白組、白藜蘆醇處理組、過氧化氫處理組、聯合處理組ROS水平分別為14.46±1.24、14.31±0.93、201.82±12.52、76.29±5.76，空白組、白藜蘆醇處理組組間比較無顯著差異(P＞0.05)，其它各組間比較差異極為顯著(P＜0.01)。ABCA12 mRNA水平分別為1.00±0.23、2.39±0.58、0.19±0.06、0.73± 0.13，各組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。蛋白表達水平分別為1.00±0.14、1.85±0.30、0.17± 0.04、0.55±0.07，各組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論: 氧化應激下調角質形成細胞的ABCA12表達；白藜蘆醇除了抗氧化作用外，還可以上調ABCA12的表達。

白藜蘆醇； ABCA12； 抗氧化

目前在許多皮膚疾病發病機制研究中，皮膚屏障功能日益受到關注。ABCA12(Adenosine triphosphate–binding cassette A12)作為一種ABC家族脂質轉運體，位于板層小體包膜，參與板層小體的形成，對維持正常的皮膚屏障功能起重要作用。1白藜蘆醇具有抗老化、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、免疫調節等一系列生物活性，2，3但在角質形成細胞脂質代謝和轉運過程中是否發揮作用尚無定論。本實驗建立表皮細胞氧化應激模型，通過白藜蘆醇的干預來研究其對表皮的抗氧化保護作用，探討白藜蘆醇對表皮細胞ABCA12表達及皮膚屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及來源 人表皮細胞系HaCaT，購自中國典型培養物保藏中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM培養液(德國Biochrom公司)、10%胎牛血清(德國Biochrom公司)、白藜蘆醇(美國 Sigma公司)、1mmol/L H2O2(美國Sigma公司)、Trizol(美國 Invitrogen公司)、DNaseI (Rnase Free)(TaKaRa，大連寶生物公司)、SYBR ExscriptTMRT－PCR Kit(TaKaRa，大連寶生物公司)、引物由上海英駿公司合成，DAFC抗體(美國Sigma公

司)，小鼠抗人 ABCA12、GAPDH一抗(美國 Santa Cruz公司)、HRP標記的羊抗小鼠二抗(美國 Santa Cruz公司)、ECL蛋白印跡發光試劑盒(美國 Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養HaCaT細胞采用DMEM培養基，添加10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 mg/L。培養條件為37℃含5%CO2飽和濕度孵箱孵育。

1.2.2 HaCaT細胞系處理及分組 根據是否采用白藜蘆醇預先干預及過氧化氫處理，設為4組(每組5例):空白組采用100 μL培養液預先干預24 h，繼以100 μL PBS緩沖液處理24 h；白藜蘆醇處理組采用0.25 μmol/L白藜蘆醇預先干預24 h，繼以100 μL PBS處理24 h；過氧化氫處理組采用100 μL培養液預先干預24 h，繼以200 μmol/L過氧化氫處理24 h；聯合處理組采用0.25 μmol/L白藜蘆醇預先干預24 h，繼以200 μmol/L過氧化氫處理24 h。取處理后細胞繼續以下檢測。白藜蘆醇濃度選擇藥液培養細胞活性無明顯降低，且相對較高的濃度0.25 μmol/L；過氧化氫濃度選擇半致死濃度200 μmol/L。

1.2.3 細胞內活性氧(ROS)檢測 調整細胞為1×l05個/孔，接種于培養板，每孔1 mL。同上處理后棄原液，胰酶消化，培養液中和，移入EP管離心3 min (4000 r/min)，棄上清液，每管加入 PBS 800 μL、DAFC抗體0.2 μL，37℃ 30 min溫育，流式細胞儀檢測。

1.2.4 總RNA的提取及Real－Time RT－PCR檢測按照試劑盒說明書進行操作。ABCA12特異引物: a1，5'－CCACAAGGAGCATAAGAA－3'；a2，5'－ATACAACCCAGGCGACCA－3'，產物片段258 bp。內參照GAPDH特異引物:b1，5'－TCCTCCACCTTTGACGCT－3'；b2，5'－CCACCACCCTGTTGCTGT－3'，產物長度為103bp。采用20 μL反應體系，PCR反應條件:95℃預變性10 s；95℃變性5 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個循環。

1.2.5 ABCA12表達的Western blot檢測 各組細胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，約20 μg總蛋白于6%SDS－PAGE凝膠中4 mA恒流電泳，恒壓100 V將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，含5%脫脂奶粉的PBS封閉液4℃封閉過夜，加入小鼠抗人ABCA12、GAPDH一抗(稀釋濃度為1∶1000)室溫孵育2 h，PBS洗膜后，加入1∶3000 HRP標記的羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜后，加入化學發光劑，生物圖像分析儀(Pharmacia，瑞典)成像，以GAPDH為內參照進行半定量分析。

1.2.6 統計學方法 計量資料采用ˉx±s表示，組間差異采用單因素方差檢驗，組間兩兩比較采用SNK檢驗，實驗數據經SPSS 16.0統計軟件包處理，顯著性水準α設為0.05。

2 結果

2.1 ROS檢測水平 空白組、白藜蘆醇處理組、過氧化氫處理組、聯合處理組各組ROS水平分別為14.46 ±1.24、14.31±0.93、201.82±12.52、76.29±5.76(圖1)。空白組、白藜蘆醇處理組組間兩兩比較差異無統計學意義(P＞0.05)，其它各組間兩兩比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖1 各組表皮細胞ROS值

2.2 ABCA12的核酸轉錄水平 過氧化氫處理組＜聯合處理組＜空白組＜白藜蘆醇處理組。空白組、聯合處理組組間兩兩比較差異無統計學意義，其它各組間兩兩比較差異有統計學意義(表1)。

2.3 ABCA12的蛋白表達水平 過氧化氫處理組＜聯合處理組＜空白組＜白藜蘆醇處理組。各組間兩兩比較差異有統計學意義(表1)。Western blot檢測見圖2。

表1 各組ABCA12的核酸轉錄及蛋白表達相對水平

轉錄水平空白組、聯合處理組組間比較P＞0.05；蛋白表達空白組、聯合處理組組間比較P＜0.05，其它各組間兩兩比較P＜0.01

圖2 各組表皮細胞ABCA12表達的變化

3 討論

ABCA12位于板層小體包膜，可將葡萄糖基神經酰胺轉運至板層小體，并將其轉變為神經酰胺，神經酰胺隨后被轉運至角質形成細胞表面，參與皮膚脂質的形成，故ABCA12在皮膚屏障功能的維持和恢復過程中具有重要作用。4，5白藜蘆醇被認為能激活SIRTl，具有抗細胞老化功能，也可激活過氧化物酶體增殖物活化受體γ協同刺激因子－1α(PGC－lα)，具有重要的抗氧化功能。6，7

在本實驗中發現，氧化應激的過氧化氫處理組ROS表達較空白組明顯增高，ABCA12表達則下降，說明表皮細胞在氧化應激狀態下出現ABCA12表達下降，可能使皮膚屏障功能降低。聯合處理組ROS表達較空白組稍增高，但較過氧化氫處理組降低，而ABCA12表達與空白組相差無幾，說明白藜蘆醇可通過抗氧化保護作用來減少ABCA12表達下降的程度，從而減少氧化應激對皮膚屏障功能的影響。白藜蘆醇處理組ROS表達較空白組無明顯變化，ABCA12表達稍有上升，說明在表皮細胞正常培養狀態下，白藜蘆醇本身亦可導致ABCA12表達增高，有助于皮膚屏障功能恢復。

故此認為氧化應激導致表皮細胞ABCA12表達下降，白藜蘆醇除了通過抗氧化保護作用來上調ABCA12表達外，理應還存在其他調控途徑。有研究表明白藜蘆醇能激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)，而AMPK是代謝過程的關鍵調節分子，可上調NAD＋水平并激活SIRTl和PGC－lα，8目前還難以明確白藜蘆醇是否能直接激活SIRTl和PGC－lα。另外有學者認為白藜蘆醇可激活 cAMP特異性的磷酸二酯酶(PDE)，參與炎性反應、脂肪生成、離子通道功能等多項生理活動。9，10所以還有諸多白藜蘆醇參與的調控途徑和方式有待進一步研究。

1 Akiyama M.The roles of ABCA12 in keratinocyte differentiation and lipid barrier formation in the epidermis.Dermatoendocrinol，2011，3(2):107－112.

2 Miki H，Uehara N，Kimura A，et al.Resveratrol induces apoptosis via ROS－triggered autophagy in human colon cancer cells. Int J Oncol，2012，40(4):1020－1028.

3 Yuan Y，Xue X，Guo RB，et al.Resveratrol enhances the antitumor effects of temozolomide in glioblastoma via ROS－dependent AMPK－TSC－mTOR signaling pathway.CNS Neurosci Ther，2012，18(7):536－546.

4 Zuo Y，Zhuang DZ，Han R，et al.ABCA12 maintains the epidermal lipid permeability barrier by facilitating formation of ceramide linoleic esters.J Biol Chem，2008，283(52):36624－36635.

5 Jiang YJ，Uchida Y，Lu B，et al.Ceramide stimulates ABCA12 expression via peroxisome proliferator－activated receptor{delta} in human keratinocytes.J Biol Chem，2009，284(28):18942－18952.

6 Yaseen A，Chen S，Hock S，et al.Resveratrol sensitizes acute myelogenous leukemia cells to histone deacetylase inhibitors through reactive oxygen species－mediated activation of the extrinsic apoptotic pathway.Mol Pharmacol，2012，82(6):1030－1041.

7 Hirzel E，Lindinger PW，Maseneni S，et al.Differential modulation of ROS signals and other mitochondrial parameters by the antioxidants MitoQ，resveratrol and curcumin in human adipocytes.J Recept Signal Transduct Res，2013，33(5):304－312.

8 Hong SH，Lee HJ，Sohn EJ，et al.Anti－nephrolithic potential of resveratrol via inhibition of ROS，MCP－1，hyaluronan and osteopontin in vitro and in vivo.Pharmacol Rep，2013，65(4): 970－979.

9 Eo SH，Cho H，Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide－Induced apoptosis via the NF－Kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes.Biomol Ther(Seoul)，2013，21(5):364－370.

10 Farris P，Krutmann J，Li YH，et al.Resveratrol:a unique antioxidant offering a multi－mechanistic approach for treating aging skin.J Drugs Dermatol，2013，12(12):1389－1394.

(收稿:2014－06－11 修回:2014－08－31)

Effects of resveratrol on ABCA12 expression in HaCaT cells

LI Jun，CHEN Jin-ping，WU Jia.Department of Dermatology，Newborn Screening Center，Guangzhou Women and Children's Medical Center，Guangzhou，510623

Objective:To determine the influence of resveratrol on ABCA12 expression in HaCaT cells. Methods:HaCaT cells cultured in DMEM were divided into the blank group，resveratrol group，hydrogen peroxide group and resveratrol combined hydrogen peroxide group.The level of reactive oxygen species(ROS) was detected by flow cytometry.The level of ABCA12 mRNA was detected by RT－PCR and the expression level of ABCA12 protein was detected by Western blot.Results:The level of ROS in the blank control group，resveratrol group，hydrogen peroxide group and resveratrol combined hydrogen peroxide group was 14.46± 1.24，14.31±0.93，201.82±12.52 and 76.29±5.76 respectively.There was no significant difference between blank group and resveratrol group(P＞0.05).The differences between other groups were highly significant(P＜0.01).The level of ABCA12 mRNA was 1.00±0.23，2.39±0.58，0.19±0.06 and 0.73±0.13 respectively. There was a significant difference among four groups(P＜0.05).The expression level of ABCA12 protein was 1.00±0.14，1.85±0.30，0.17±0.04 and 0.55±0.07 respectively.There was a significant difference among four groups(P＜0.05).Conclusion:Oxidative stress inhibits the expression of ABCA12 in cells.Besides antioxidant protection，resveratrol up－regulate the expression of ABCA12.

resveratrol；adenosine triphosphate－binding cassette A12；antioxidant

廣州市婦女兒童醫療中心，廣東廣州，510623