海藻糖對過氧化氫誘導M14黑素瘤細胞氧化損傷的保護作用

張 宇 王寶璽 姚 煦李誠讓

·論著·

海藻糖對過氧化氫誘導M14黑素瘤細胞氧化損傷的保護作用

張 宇 王寶璽 姚 煦?李誠讓?

目的: 確定海藻糖對過氧化氫誘導的M14黑素瘤細胞損傷的保護作用。方法: 不同濃度過氧化氫處理后的M14黑素瘤細胞加入0.5 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL海藻糖，采用MTT法檢測各組細胞存活率，嘌呤氧化酶法檢測處理前后超氧化物歧化酶(SOD)的活性。結果: 濃度為1 μg/mL的海藻糖抗氧化作用明顯，可提高低濃度過氧化氫(小于400 μmol/L)損傷后的M14黑素瘤細胞存活率約33%，可提高SOD活力約20%。當過氧化氫濃度大于400 μmol/L時，各濃度海藻糖對提高細胞存活率無明顯作用。結論: 1 μg/mL海藻糖對低濃度(小于400 μmol/L)過氧化氫誘導的M14黑素瘤細胞損傷具有保護作用。

過氧化氫； 黑色瘤細胞； 氧化應激； 海藻糖

白癜風是常見的色素脫失性皮膚病，發病率約占世界人口總數的1%。1其發病機制包括自身免疫損傷、黑素細胞自身破壞和神經源學說等。黑素細胞自身破壞學說2，3指出，黑素細胞合成黑素時產生醌類和酚類中間產物，有些中間產物不穩定可形成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，這些中間產物和ROS對黑素細胞有毒性作用，稱之為毒性黑素前體。事實上，人體細胞在新陳代謝供能的過程中細胞內持續產生ROS，ROS是一類性質十分活潑的化學集團，主要包括超氧自由基、羥自由基、氫過氧化物自由基、過氧化氫和單線態氧。其中超氧化物歧化酶(SOD)是細胞產生氧化損傷的主要指標，過氧化氫酶(catalase，CAT)是清除過氧化氫的主要酶之一。如清除酶減少或缺陷ROS將攻擊蛋白質、核酸，引起這些大分子物質結構和功能的改變。同時，ROS可作用于多種不飽和脂肪酸，以鏈式和鏈式支鏈反應的形式生成脂氫過氧化物，進而生成丙二醛(malonaldehyde，MDA)破壞細胞生物膜的結構和功能。4外界環境中的紫外線、外傷、空氣污染、農藥、吸煙等都有產生氧化應激加劇對生物大分子的破壞，導致白癜風的發生。

建立成功可靠的氧化應激模型，對于部分揭示白癜風發病機制以及研究和篩選抗氧化藥物都有重要意義。過氧化氫是一種重要的活性氧，極易透過細胞膜，與細胞內鐵離子通過Fenton反應形成高活性的自由基，導致一系列反應，其易于獲得，性質相對穩定，所以它已成為研究細胞氧化損傷的重要工具。5本研究以黑素瘤M14細胞為基礎，以過氧化氫應激誘導劑構建體外氧化應激細胞模型。初步用MTT法檢測

細胞活力，并檢測SOD以摸索過氧化氫的最佳作用濃度，構建體外氧化應激細胞模型，為后續研究篩選抗氧化劑的生物芯片實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 M14(黑素瘤細胞)(購自凱基公司，貨號:KG059)。青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、1640培養基、H2O2、DMSO、海藻糖 (購自祥研生物技術中心)；胎牛血清 (購自杭州四季青)；測定與分析用水均為超純水。CO2培養箱(Thremo，美國，型號BBD 6220)；潔凈工作臺(Thermo，美國，型號BBSSSC)；高性能冷凍離心機(Thermo，美國，型號MR23i)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本，型號IX71)；酶標儀(全光波段)(TECAN，瑞士，型號Safire2)；超聲波細胞破碎(比朗，中國，型號BILON92－11DL)。

1.2 方法

1.2.1 黑素瘤細胞(M14)培養 將M14細胞接種在1640培養基(含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/ mL鏈霉素、2 mmol/L L－谷氨酰胺，PH 7.2)中。37℃、5%CO2溫育。細胞為多角形貼壁生長細胞，約2～3天傳代1次，按5×105個/mL密度，96孔板中每孔接種50 μL，待細胞進入對數生長期(細胞數量較多，貼壁完好)繼續實驗。

1.2.2 實驗分組及藥物處理 調零孔:1640培養基200 μL；PBS毒性孔:進入對數生長期的細胞，PBS 200 μL；H2O2處理組:加入對數生長期細胞H2O2使終濃度為800 μmol/L，400 μmol/L，200 μmol/L，100 μmol/L；海藻糖毒性組:PBS配制海藻糖溶液，終濃度為0.5 μg/mL，1 μg/mL，10 μg/mL。

加入海藻糖保護劑組:對數生長期細胞分別加入H2O2100 μL和海藻糖100 μL，H2O2終濃度為400 μmol/L，200 μmol/L，100 μmol/L及海藻糖終濃度為0.5 μg/mL，1 μg/mL，10 μg/mL。

1.2.3 細胞形態觀察 黑素瘤細胞(M14)形態通過倒置熒光顯微鏡10X目鏡、20X物鏡(Nikon Eclipse Ti－U，尼康公司)觀察并拍照。

1.2.4 噻唑藍(MTT)法檢測細胞存活率6取對數生長期M14黑素瘤細胞，以按5×105個/mL密度，96孔板中每孔接種 50 μL，共設 10組，每組3個孔，于37℃、5%CO2培養24 h，細胞融合至90%，貼壁完好，分別檢測H2O2、海藻糖對M14黑素瘤細胞存活率影響加入各濃度H2O2、海藻糖100 μL。保護組加入H2O2、海藻糖各100 μL作用60 min，然后每孔加入10 μL，5 g/L的MTT，溫育4 h，去除培養液及MTT，小心吸取上清，每孔加入150 μL DMSO，用酶標儀測定各孔在波長570 nm處的吸光度。

1.2.5 SOD活力測定 取H2O2、H2O2和海藻糖作用的M14黑素瘤細胞，制成細胞懸液，將細胞懸液置于冰水條件下，超聲破碎，功率130 w，3～5 s/次，間隔30 s，重復5～7次，取200 μL，破碎好的勻漿液進行測定。參照南京建成生物工程研究所提供的相應試劑盒說明書測定細胞內SOD活力。SOD活力單位定義為每毫克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD酶活力為一個酶活力單位(U)；蛋白質定量采用考馬斯亮藍比色法測定。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，兩組間的數據比較采用t檢驗。實驗數據用ˉx±s表示，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 細胞形態觀察結果 不同濃度的H2O2作用于M14黑素瘤細胞60 min后，低濃度(100 μmol/L) H2O2作用M14黑素瘤細胞后形態與正常對照比較無差異。高濃度(大于400 μmol/L)H2O2作用后的M14黑素瘤細胞數量減少，呈大細胞，小細胞，細胞兩級延長不規則形態，出現空泡變性，并喪失貼壁功能。

2.2 過氧化氫呈濃度依賴性損傷M14黑素瘤細胞及抑制M14黑素瘤細胞活性，1 μg/mL海藻糖有效抑制過氧化氫對M14細胞損傷及活力影響 使用MTT法檢測不同濃度的H2O2對M14黑素瘤細胞存活率和細胞活性的影響，發現作用于M14黑素瘤細胞60 min后，各濃度H2O2作用細胞存活率與正常對照組相比均降低(P＜0.01)。但隨著H2O2濃度升高細胞存活率逐漸降低，當大于400 μmol/L后M14細胞存活率及活性變化無差異(P＞0.05)，見圖1。不同濃度的海藻糖作用于M14細胞60 min后，與正常對照組相比對細胞存活率及活力無影響，見圖2。

圖1 MTT法檢測顯示過氧化氫呈濃度依賴性損傷M14黑素瘤細胞且呈濃度依賴性抑制M14黑素瘤細胞活性，與PBS組比較有差異(?P＜0.01)

1 μg/mL海藻糖加入H2O2處理組同時作用60 min，可抵抗過氧化氫對細胞損傷并提高細胞活性，見

圖3。當過氧化氫濃度高于400 μmol/L時，海藻糖抵抗過氧化氫引起細胞損傷及活力影響的保護作用降低。當選用10 μg/mL海藻糖加入H2O2處理組時保護作用不明顯。

圖2 MTT法檢測顯示各濃度海藻糖對M14細胞存活率及活性的影響與PBS組比較無差異(P＞0.05)

圖3 海藻糖對H2O2引起M14黑素瘤細胞凋亡的保護作用

2.3 過氧化氫對黑素瘤細胞(M14)SOD活性影響及加入海藻糖防護后SOD活性變化 不同濃度的H2O2作用于M14黑素瘤細胞1 h后，與正常對照組相比，100 μmol/L H2O2處理對SOD活力無明顯影響(P＝0.095)，未對黑素瘤細胞產生較大的氧化損傷。當逐漸提高過氧化氫濃度，與正常對照比較100 μmol/L H2O2處理組SOD活力明顯降低，400 μmol/L H2O2對SOD活力的影響較大(??P＜0.01)，見圖4。當1 μg/mL海藻糖加入H2O2，處理組時可提高被過氧化氫抑制的SOD活力(P＜0.01)，對過氧化氫引起的黑素瘤細胞氧化損傷有保護作用，見圖5。

圖4 與正常對照組相比100 μmol/L過氧化氫處理組SOD活力明顯降低(?P＜0.05)，400 μmol/L H2O2對SOD活力的影響較大(??P＜0.01)

圖5 當1 μg/mL海藻糖加入100 μmol/L H2O2處理組時可提高被過氧化氫抑制的SOD活力(?P＜0.05)，對過氧化氫引起的黑素瘤細胞氧化損傷有保護作用(100 μmol/L H2O2，P＝0.01)，當H2O2處理組達到400 μmol/L時，海藻糖仍可提高SOD活力(400 μmol/L H2O2，P＝0.008)

3 討論

皮膚是機體與外界環境接觸的重要界面，經常暴露于各種物理、化學及生物性物質中。其中，許多物質或其代謝物可直接或間接地催化產生一系列活性氧化物，統稱為ROS。常見的氧化物包括來自汽車及其他工業源的氣態環境污染物、紫外線輻射、食物污染物/添加劑/防腐劑、護膚類產品、藥物等。7ROS包括單線態氧、超氧陰離子、H2O2、羥自由基、一氧化氮等。迄今為止，已經有大量證據表明白癜風患者表皮內和血淋巴細胞和單核細胞內有微量過氧化氫的蓄積。正常情況下，皮膚ROS的產生與清除處于動態平衡之中，而白癜風中這一平衡被打破。在進展期白

癜風患者表皮內可檢測到濃度范圍為10－3M的H2O2蓄積，8遠遠高于生理濃度10－7M－10－6M。異常產生的H2O2的來源已部分明確，分為外源性和內源性。前者例如UVA/UVB照射，X－線照射，接觸酚類、氫醌類制劑，后者包括表皮單胺氧化酶A、誘導型一氧化氮合酶及NADPH氧化酶活性升高，TNF－α水平增高，6－生物蝶呤和墨蝶呤的光氧化增強，6R－左－紅－5，6，7，8，四氫生物蝶呤生物合成/再循環通路紊亂、雌激素/黃體激素介導的H2O2產生等。同時，白癜風患者中抗氧化的CAT、硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶表達/活性降低。ROS的生成大于清除，導致氧化應激。

諸多研究顯示白癜風中的氧化－抗氧化格局發生了改變，Agrawal等9報道患者外周血紅細胞中SOD活性劑脂質過氧化水平顯著升高，GSH濃度及谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著降低，紅細胞中CAT活性及血漿維生素E濃度無明顯差異。Koca等4報道患者血漿丙二醇濃度及黃嘌呤氧化酶活性顯著增高。也有研究報道紅細胞中谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著升高以及CAT活性顯著降低。在組織水平，患者表皮SOD、丙二醇、谷胱甘肽過氧化物酶的表達量明顯升高，而一氧化氮水平無明顯差異。文獻報道，10白癜風皮損區 MSRA的表達/活性顯著降低，10－3M的H2O2可使重組MSRA，MSRB的活性分別下降85%，40%。同時，周舟等11研究表明，MSRA表達水平下降會導致黑素細胞對氧化應激的敏感性增高，同時MSRA表達水平下降及失活不利于黑素細胞功能及生存。H2O2介導的氧化應激不僅顯著降低白癜風患者中的MSRA表達水平，而且MSRA自身也因H2O2氧化而失活。Giovannelli等12－18發現白癜風患者外周單個核細胞DNA鏈斷裂及DNA堿基被氧化的水平顯著高于對照組。

脂質過氧化作用不僅把活性氧轉化成活性化學劑，而且通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用。因此，初始的一個活性氧能導致很多脂類分解產物的形成，這些分解產物部分能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產物引起細胞損傷。學者推測，白癜風中存在著一個惡性循環，H2O2使抗氧化酶失活，一方面導致清除ROS的能力下降，另一方面紊亂的黑素合成/代謝通路及6BH4再循環通路會異常產生更多的H2O2。

皮膚的抗氧化防御系統隨著有氧代謝共同發展以拮抗ROS的不利影響。這些抗氧化分子包括氧化酶，如SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽－S－轉移酶、硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶、醌還原酶。還包括一些小分子物質，如維生素C、維生素E、GSH、硫醇、氨基酸中的甲硫氨酸和色氨酸，6、7－四氫生物蝶呤、類脂酸以及非金屬的硒。4SOD作為唯一的以自由基為底物的酶，可將單線態氧歧化為H2O2，CAT可將H2O2分解為水和氧。可作為細胞氧化損傷的標志，SOD活性增強，是由于機體內氧自由基增多，SOD活性代償性升高。而丙二醛(MDA)的量常常反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。基于以上發現，通過清除表皮H2O2而實現色素恢復是治療白癜風的途徑之一。海藻糖是在酵母中發現的二糖，海藻糖對生物體具有神奇的保護作用，在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環境條件下在酵母細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。海藻糖應用于保濕類化妝品及食品防腐劑具有抗氧化作用。

本實驗擬在體外構建黑素瘤細胞(M14)氧化應激細胞模型，該模型在100 μmol/L至400 μmol/L濃度的過氧化氫誘導下，細胞功能改變，但是這種損傷不會造成細胞死亡，而且在適宜的抗氧化劑的作用下，這些損傷還有可能被修復，但高濃度過氧化氫長時間作用細胞就可觸發細胞器質性損害和不可逆損傷。既往實驗證實基因產生表達變化間隔時間為4 h，18同時考慮到長時間的氧化作用會對細胞造成不可逆損傷甚至死亡，19因此本實驗選擇過氧化氫作用細胞的時間為60 min。本研究使用MTT法檢測細胞存活率，MTT進入細胞后被線粒體脫氫酶還原生成藍色formazan顆粒，經溶劑溶解后比色定量，其顏色深淺直接與活細胞數有關，從而確定其存活率。同時本實驗根據細胞代謝活動與活細胞數直接成比例的原理，通過測定M14黑素瘤細胞代謝活性的減少來衡量H2O2作用M14細胞引起氧化應激損傷的程度。從實驗結果可見，不同濃度的H2O2作用于M14黑素瘤細胞60 min后，各濃度H2O2作用細胞存活率與正常對照組相比均降低。隨著H2O2濃度升高，細胞存活率逐漸降低。而加入保護劑組，即同時加入1 μg/mL海藻糖和H2O2作用M14細胞60 min，細胞存活率及活性與H2O2單獨處理組相比有升高。但是海藻糖對高濃度H2O2處理損害細胞已無保護作用。低濃度H2O2對M14黑素瘤細胞的活性有影響，如細胞內DNA，脂質和蛋白質會有變化，但是這種損傷不會造成細胞死亡，加入膜保護劑后細胞活性恢復，因此根據實驗結果過氧化氫的最佳作用濃度范圍為100

μmol/L至 400 μmol/L。如果高濃度 H2O2使細胞DNA產生不可逆性損傷，因海藻糖不能使受損DNA恢復，此時對細胞的保護作用有限。

本實驗結果表明，過氧化氫作用M14黑素瘤細胞后引起可逆性損害的濃度為100 μmol/L至400 μmol/L，作用時間為60 min，可以成功構建過氧化氫誘導M14細胞體外氧化應激模型。并摸索出膜保護劑海藻糖濃度為1 μg/mL時可提高過氧化氫損傷細胞的存活率。本模型具備操作簡便、模擬性和可控性，為進一步揭示氧化應激機制以及研究和篩選抗氧化藥物奠定了實驗基礎。

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(收稿:2014－07－01 修回:2014－10－08)

Protection of trehalose against damage of hydrogen peroxide to melanoma cell lines M14

ZHANG Yu，WANG Bao-xi，YAO Xu，et al.Institute of Dermatology，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the protective effect of trehalose against the damage of hydrogen peroxide to the melanoma cell lines M14.Methods:Melanoma cell lines M14 induced by hydrogen peroxide were re－cultured by different concentrations of trehalose(0.5 μg/mL，1 μg/mL，10 μg/mL).The cell survival rate was detected by MTT.The activity of SOD was detected by xanthine oxidase technique.Results:The antioxidation of 1 μg/mL trehalose was obvious.1 μg/mL trehalose improved the survival rate and the activity of SOD of M14 cells induced by low－concentration(＜400 μmol/L)hydrogen peroxide by 33%and 20%respectively.The survival rate of M14 cells induced by high－concentration(＞400 μmol/L)hydrogen peroxide was not increased after re－cultured in different concentrations of trehalose.Conclusion:1 μg/mL trehalose is protective against the damage of low－concentration(＜400 μmol/L)hydrogen peroxide to the melanoma cell lines M14.

H2O2；melanoma cells；oxidative stress；trehalose

中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所，南京，210042

?通信作者