黑皺鰓金龜甲殼素提取工藝研究

張建英，賈 龍，楊貴軍，石曉莉

(1.寧夏大學生命科學學院，銀川 750021;2.寧夏大學農學院，銀川 750021)

黑皺鰓金龜Trematodes tenebrioides (Pallas)又名無后翅金龜子，隸屬于鞘翅目Coleoptera 鰓金龜科Melolonthidae (章有為，1979)。黑皺鰓金龜是世界范圍內的一大地下害蟲，為害多種作物和牧草(烏寧等，2002;劉新民和烏寧，2004)，主要分布于包括我國在內的古北區國家或地區(張林林等，2012)。成蟲體中型，長15.0-16.0 mm，寬6.0-7.5 mm，黑色無光澤，刻點粗大而密，鞘翅卵圓形，具大而密排列不規則的圓刻點，后翅退化僅留痕跡，略呈三角形(章有為，1979)。成蟲為害幼苗莖、葉，喜食灰菜、刺兒菜及熒菜等野生植物，也是甘草的地下害蟲。幼蟲除主要為害高粱、玉米、大豆、花生(曲明靜等，2011)、土豆(郭成瑾等，2012)、小麥、棉花等作物，嚙食幼苗地下莖和根部，使幼苗滯長、枯黃、全株枯死;幼蟲也是內蒙古典型草原大型土壤動物的優勢種，起著分解動植物殘體和牧畜糞便，分解轉化有機質和礦物質的重要作用。

甲殼素又名甲殼質、幾丁質等，是自然界中唯一帶正電荷的天然高分子聚合物，化學名稱為(1，4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖(王敦等，2004;劉高強等，2007)。主要存在于甲殼動物外殼、軟體動物內骨骼、昆蟲表皮、菌類及藻類等微生物的細胞壁中(王金華和干信，2003)。每年地球上的生物合成量約為100 億噸，是產量僅次于纖維素的第二大可再生資源，也是除蛋白之外數量最大的含氮天然有機高分子(李維莉和林南英，1999;王敦等，2004;陽范文和陳曉明，2012)。甲殼素具有非常優秀的再生能力，其化學結構和植物纖維素非常相似，具備特殊的理化性質，天然無毒、組織相容性良好、可生物降解，其開發應用已涉及工業、農業、國防、化工、環保、食品、醫藥、保健、美容、紡織等諸多領域(施林妹等，2013;王月等，2013)。目前甲殼素的生產方法主要有酸堿法(張雪和王雪濤，2007;唐義寶和謝晶，2012)、酶法(段元斐等，2007)、電解法(賀淹才等，2000)、發酵法(周湘池等，2008)、EDTA 法(何蘭珍等，2008)等。通過前人從蠅、蠶等一些蟲種中提取甲殼素的研究發現，昆蟲中甲殼素含量比較高，鈣和重金屬含量低，雜質少，純度高，質量好，提取過程中對水、酸、堿消耗少，生產成本低。因此，昆蟲甲殼素要優于蝦、蟹甲殼素，開發新的甲殼素資源具有重要的意義，而資源量大、種類多的昆蟲正是潛在的甲殼素來源。據估算昆蟲的總生物量超過了地球上所有動物總生物量，適應能力和分布范圍都超過了其它動物群，但被人類利用的昆蟲資源卻很少，只占昆蟲種類的萬分之一左右，因而昆蟲甲殼素資源是有待開發的優勢資源(吉惠杰和馬艷麗，2012)。

目前國內已有蠶蛹、蜣螂、蟋蟀等昆蟲中甲殼素的提取報道，但有關甲蟲中甲殼素資源的開發信息甚少。因此，本試驗擬以黑皺鰓金龜為材料，采用酸堿法研究甲殼素的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

黑皺鰓金龜成蟲干粉，成蟲采自內蒙古烏審旗。樣品預處理:洗凈→烘干(60℃)→研磨→過篩→黑皺鰓金龜干粉。

1.1.2 主要儀器及用具

電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋，北京長源實驗設備廠;紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;馬弗爐sx4-10，深圳市中達電爐廠;紅外光譜儀，德國布魯克;低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠;PH 計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;研缽;稱量瓶;三角瓶等。

1.1.3 主要試劑

檸檬酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、標準甲殼素樣品(美國進口C9752-250MG)、高錳酸鉀(分析純)、草酸(分析純)、蒸餾水(水洗使用)。

1.2 方法

試驗利用酸浸堿煮法，首先，通過單因素試驗對氫氧化鈉濃度、堿浸固液比、堿浸時間、堿浸溫度、檸檬酸濃度、酸浸固液比、酸浸時間等七個因素進行探究，以殘余蛋白質和灰分含量為考察指標，確定從黑皺鰓金龜中提取甲殼素的初步制備工藝條件;再以單因素試驗所得結果進行正交試驗設計以優化工藝條件，采用紫外吸收法測定殘留蛋白質含量(陳毓荃，2002)，以殘留蛋白質含量為指標來衡量氫氧化鈉脫除蛋白質的效果;采用干法灰化法測定灰分含量 (參見GB 5009.4-2010)，以殘留灰分為指標來衡量檸檬酸脫除無機鹽的效果;最后按照正交試驗所得的最佳工藝條件進行甲殼素的提取并利用紅外光譜比對法進行定性分析并計算其得率。蛋白質(μg/mL)=(1.45A280-0.74A260)×稀釋倍數;總灰分(%)=(恒重后坩堝和灰分重量-恒重后坩堝重量)/樣品重量×100。

1.2.1 單因素試驗脫除蛋白質條件的探究

影響脫除蛋白質效果的有氫氧化鈉濃度、堿浸溫度、堿浸時間、固液比等四個因素。在單因素試驗探究中，將其中三個因素固定為固定值，第四個因素設計成五個水平，以殘留蛋白質含量為指標來確定上述五個水平那哪個為最適值。

1.2.2 單因素試驗脫除無機鹽條件的探究

影響脫除無機鹽效果的有檸檬酸濃度、酸浸時間、固液比等三個因素。在單因素試驗探究中，在室溫條件下，將其中兩個因素固定為固定值，第三個因素設計成五個水平，以殘留灰分含量為指標來確定上述五個水平哪個為最適值。

1.2.3 氫氧化鈉脫除蛋白質的正交試驗設計

在單因素試驗得到的最適氫氧化鈉濃度、堿浸時間、堿浸溫度、固液比的基礎上，選擇氫氧化鈉濃度、堿浸時間、堿浸溫度、固液比四個因素為考察對象，在單因素試驗得到的四個因素最適值兩端再各取一個水平，設計四因素三水平正交試驗對工藝條件進行優化。正交試驗設計見表1，重復2 次。

表1 脫除蛋白質的正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels of deproteinization orthogonal experiment

1.2.4 檸檬酸脫除無機鹽的正交試驗設計

在單因素試驗得到的最適檸檬酸濃度、酸浸時間、固液比的基礎上，在室溫條件下，選擇檸檬酸濃度、酸浸時間、固液比三個因素為考察對象，在單因素試驗得到的三個因素最適值兩端再各取一個水平，設計三因素三水平正交試驗對工藝條件進行優化。正交試驗設計見表2，重復2 次。

1.2.5 甲殼素的制備的工藝流程

新鮮甲蟲→預處理→脫除蛋白質→水洗至中性→脫除無機鹽→水洗至中性→干燥→脫色→甲殼素樣品(彭元懷等，2012)。

1.2.6 甲殼素的定性定量分析

甲殼素定性檢測采用紅外光譜對比法:分別將標準甲殼素和所制備的甲殼素烘干，2 mg 待測樣品與100 mg KBr 混合，通過壓片法制成薄片，用紅外光譜儀掃描范圍400-4000/cm (包淑云等，2012)，通過對比兩者的紅外光譜圖，確定本研究制備的樣品是否為甲殼素。

甲殼素得率計算方法(王敦等，2004;郭寶華，2005):甲殼素含量(%)=(所提甲殼素重量干重W1)/ (所用該種昆蟲干重W2)×100

表2 脫除無機鹽的正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of demineralization orthogonal experiment

2 結果與分析

2.1 單因素試驗脫除蛋白質條件的探究

2.1.1 氫氧化鈉濃度的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，依次以固液比1∶12 加入質量分數4%、6%、8%、10%、12%氫氧化鈉溶液，置于90℃水浴鍋中恒溫5 h，水洗至中性，得脫除蛋白質的黑皺鰓金龜粉，測定其殘余蛋白質含量，重復3 次，結果見圖1。氫氧化鈉濃度越高，脫除蛋白質的效果越好，氫氧化鈉質量分數8%時，殘余蛋白質含量0.760 μg/mL，而氫氧化鈉質量分數10% 時，殘余蛋白質含量0.701 μg/mL，即當氫氧化鈉質量分數大于8%后，對脫除蛋白質的影響效果不大，且隨著氫氧化鈉質量分數的增加易使甲殼素脫乙酰化生成殼聚糖。因此，選擇質量分數8%的氫氧化鈉溶液浸泡即可。

圖1 堿濃度對脫除蛋白質的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on deproteinization

2.1.2 堿浸溫度的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，以固液比1∶12、質量分數8%加入氫氧化鈉溶液，分別置于80℃、85℃、90℃、95℃、100℃水浴鍋中恒溫5 h 后水洗至中性，得脫除蛋白質的黑皺鰓金龜粉，測定其殘余蛋白質含量，重復3 次。結果見圖2。隨著堿浸溫度的升高，殘余蛋白質含量急劇下降，脫除蛋白質效果明顯;當達到85℃以后，殘余蛋白質含量下降的趨勢減緩。溫度對氫氧化鈉水解蛋白質有很大的影響，在其它條件固定的情況下，反應溫度越高，蛋白質堿水解的速度越快;但溫度達到一定值時，蛋白質堿水解速度開始變慢，蛋白質的堿水解反應趨于平衡，繼續升溫對脫除蛋白效果影響不大。同時考慮到高溫反應會增加生產成本，因此，選擇堿浸溫度85℃即可。

圖2 反應溫度對脫除蛋白質的影響情況Fig.2 Effect of temperature on deproteinization

2.1.3 堿浸時間的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，以固液比1∶12、質量分數8%、水浴溫度90℃，分別恒溫1 h、3 h、5 h、7 h、9 h 后水洗至中性，得脫除蛋白質的黑皺鰓金龜粉，測定其殘余蛋白質含量，重復3 次。結果見圖3。在反應的初始階段，隨著堿浸時間的延長，殘余蛋白質含量急劇下降，脫除蛋白效果明顯;在5 h 后其蛋白質含量總體雖在下降，但下降的趨勢減緩。一般來說，脫除蛋白質時間越長，蛋白質水解的越徹底，但水解速度逐漸減慢;當延長到某一時刻以后，蛋白質的水解反應進行得非常緩慢，其對脫除蛋白效果的影響便不再明顯。同時考慮到長時間高溫反應會帶來生產成本上的增加，因此，選擇堿浸時間5 h 即可。

圖3 堿浸時間對脫除蛋白質的影響情況Fig.3 Effect of reaction time on deproteinization

2.1.4 堿浸固液比的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，分別以固液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 加入質量分數8%氫氧化鈉溶液，置于90℃水浴鍋中恒溫5 h，水洗至中性，得脫除蛋白質的黑皺鰓金龜粉，測定其殘余蛋白質含量，重復3 次。結果見圖4。固液比對反應的影響不是很明顯，但固液比越大，脫除蛋白質的效果越好，固液比1∶10 時，殘余蛋白質含量為0.371 μg/mL，而當固液比1∶12 時，殘余蛋白質含量為0.329 μg/mL，即當固液比大于1∶10 時，對除蛋白質的影響不是很大，因此，選擇固液比1∶10 浸泡即可。

圖4 固液比對脫除蛋白質的影響情況Fig.4 Effect of ratio of liquid to material removal of protein

2.2 單因素試驗脫除無機鹽條件的探索

2.2.1 檸檬酸濃度的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000g，分別置于錐形瓶中，室溫條件下，以固液比1∶11 分別加入濃度0.6 g ∕L、1.0 g/L、1.4 g/L、1.8 g/L、2.2 g/L檸檬酸溶液，反應時間30 h，水洗至中性，得脫除無機鹽黑皺鰓金龜粉，測定其灰分含量，重復3 次。結果見圖5。隨著檸檬酸濃度的增加，灰分含量逐漸下降，脫除無機鹽效果明顯;檸檬酸濃度達到1.4 g/L 后其灰分含量總體也在下降，但下降趨勢不明顯，當濃度由1.4 g/L 變為1.8 g/L時，灰分含量由1.70% 變為1.57%，灰分含量減少量不大，且隨著檸檬酸濃度的增加甲殼素易于水解。同時考慮在實際操作中，檸檬酸濃度過高會使反應速率過快而不易控制，因此，選擇檸檬酸濃度1.4 g/L 較為合適。

圖5 檸檬酸濃度對脫除無機鹽的影響情況Fig.5 Effect of citric acid concentration on demineralization

2.2.2 酸浸時間的確定

稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000g，分別置于錐形瓶中，室溫條件下，以固液比1∶11 加入濃度1.4 g/L 檸檬酸溶液，恒溫20 h、25 h、30 h、35 h、40 h，水洗至中性，得脫除無機鹽黑皺鰓金龜粉，測定其灰分含量，重復3 次。結果見圖6。在反應的初始階段，隨著酸浸時間的延長，灰分含量急劇下降，脫除無機鹽效果明顯;達到25 h以后其灰分含量總體也在下降，但下降趨勢減緩。由于殼中碳酸鈣是與甲殼素以及蛋白質結合在一起，在檸檬酸與碳酸鈣的反應中，部分碳酸鈣被甲殼素緊密的膠狀分子團結構所包圍，檸檬酸很難完全滲透到里面，導致其不能徹底與其反應完全。當達到25 h 以后，檸檬酸和碳酸鈣的反應基本達到平衡，再延長時間對脫除無機鹽效果的影響不大。因此，選擇酸浸時間為25 h 即可。

圖6 酸浸時間對脫除無機鹽的影響情況Fig.6 Effect of reaction time on demineralization

2.2.3 酸浸固液比的確定

準確稱取5 份黑皺鰓金龜粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，室溫條件下，分別以固液比1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15 加入濃度1.4 g/L 的檸檬酸溶液，恒溫30 h，水洗至中性，得脫除無機鹽黑皺鰓金龜粉。測定其灰分含量，重復3 次。結果見圖7。固液比由1∶9 變至1∶11 時，灰分含量下降趨勢較為明顯，由2.39% 變為1.55%，而當固液比由1∶11 變至1∶13 時灰分含量有所減少但很緩慢，由1.55% 變為1.52%，因此，選擇固液比1∶11 浸泡洗脫除無機鹽即可。

圖7 酸浸固液比對脫除無機鹽的影響情況Fig.7 Effect of liquid-solid ratio on demineralization

2.3 氫氧化鈉脫除蛋白質的正交試驗

稱取9 份黑皺鰓金龜干粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，按表1 正交試驗設計的9種組合進行試驗，重復2 次取平均值。結果見表3。由正交試驗結果可得最佳試驗條件為A2、B1、C2、D2，即氫氧化鈉濃度8%，固液比1∶10，在85℃下反應4 h即可。且又由結果可得A ＞C ＞B ＞D，即四個因素影響脫除蛋白質的主次順序為:反應溫度＞固液比＞堿浸時間＞氫氧化鈉溶液濃度。

表3 脫除蛋白質的正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal test results of deproteinization

2.4 檸檬酸脫除無機鹽的正交試驗

稱取9 份黑皺鰓金龜干粉1.000 g，分別置于錐形瓶中，按表2 正交試驗設計的9種組合進行試驗，重復2 次取平均值。結果見表4。由正交試驗結果可得最佳條件為A2、B3、C3，即檸檬酸濃度1.6 g/L，固液比1∶12，在室溫條件下反應25 h 即可，且又由結果可得B ＞C ＞A，即在室溫條件下，三個因素影響檸檬酸脫除無機鹽的主次順序為:檸檬酸濃度＞固液比＞反應時間。

2.5 甲殼素的制備及其定性定量分析

2.5.1 甲殼素的制備

按照正交試驗得到的最佳試驗條件，將準確稱取的黑皺鰓金龜干粉置于錐形瓶中，以固液比1∶10 加入質量分數8%氫氧化鈉溶液，置于溫度為85℃反應4 h，水洗至中性，得脫除蛋白質黑皺鰓金龜粉，烘干后再以固液比 1∶12 加入濃度1.6 g/L，的檸檬酸溶液，置于室溫條件下恒溫25 h，水洗至中性，烘干后可得脫除蛋白質與無機鹽的粗產品，再進行脫色處理(張雪和王雪濤，2007)，用3%的高錳酸鉀溶液，以固液比1∶10，在室溫下處理0.5 h，再用2%草酸溶液以固液比1∶20，在70℃進行還原脫色處理，即可得到白色蓬松的甲殼素產品。

2.5.2 甲殼素的定性分析

甲殼素的紅外吸收光譜分析，對在最佳條件下制備的甲殼素產品進行質量分析與結構表征。甲殼素產品紅外光譜如圖8 所示，紅外光譜圖中3400 cm-1是O-H 伸縮振動吸收峰;3270 cm-1是N-H 伸縮振動吸收峰;2960-2879 cm-13 個吸收峰是C-H 伸縮振動吸收峰;分別在1657、1557、1315 cm-1的吸收峰，分別是酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ譜帶，這3 個吸收峰是甲殼素的特征吸收峰;1030-1157 cm-1之間的4 個吸收峰，是C-O 伸縮振動吸收峰;897 cm-1是環伸縮振動吸收峰。通過比對本工藝所得產品和購買的甲殼素標準樣品的紅外譜圖可知，本工藝提取的甲殼素與甲殼素標樣化學結構一致。

表4 脫除無機鹽的正交試驗設計及結果Table 4 Orthogonal test results of demineralization

圖8 兩種樣品的紅外光譜圖Fig.8 IR spectra of two samples

2.5.3 甲殼素的定量分析

在本試驗所得最佳工藝流程下制備甲殼素并計算其得率，結果分析可得從黑皺鰓金龜中提取甲殼素的得率為24.82% (表5)。

表5 黑皺鰓金龜粉提取甲殼素試驗數據Table 5 The experimental data of chitin extracted from Trematodes tenebrioides Pallas

3 結論與討論

本試驗對黑皺鰓金龜甲殼素的提取工藝先進行了單因素試驗，然后根據單因素的最佳條件再進行正交試驗以優化工藝流程。應用紫外吸收法分析提取物中的殘余蛋白質含量，利用干法灰化法分析提取物中殘余灰分含量。通過對試驗數據分析處理，又結合甲殼素在酸性較強的溶液中易分解，溫度高又易降解，而在堿性較強的溶液中易脫乙酰化為殼聚糖的特性，初步確定了黑皺鰓金龜甲殼素提取的最佳工藝條件:氫氧化鈉溶液質量分數8%、浸泡溫度85℃、固液比1∶10、浸泡時間4 h，檸檬酸濃度1.6 g/L、浸泡固液比1∶12、浸泡時間25 h，在以上工藝條件下制備的甲殼素產品經脫色后為乳白色蓬松固體，得率24.82%.

本試驗首次利用黑皺鰓金龜成蟲為試驗材料制備甲殼素，結果顯示，該蟲干粉甲殼素產率達24.82%，產品顏色呈乳白色絮狀固體;對其產品進行紅外光譜分析，證實了本試驗所制備的物質確為甲殼素。昆蟲作為甲殼素制備的材料來源，其自身優勢十分明顯。目前由昆蟲獲得的甲殼素產量、質量和提取流程上，具有比蝦蟹殼單位產量高、提取流程簡單、產品質量高、蛋白含量相對較少等明顯優勢，具有廣泛利用前景，能夠用于解決多種人類“文明病”。昆蟲類甲殼素制備方面的研究相對滯后，研究也局限在個別昆蟲種類。黑皺鰓金龜作為一種農業害蟲，其存在危害著農作物的生長，嚴重時影響著農業經濟的發展，將其作為提取甲殼素的原料能夠變害為寶。昆蟲豐富的物種資源以及其巨大的天然合成能力沒有得到相應的利用，相信隨著對大量不同種類昆蟲甲殼素的深入研究，必定能夠利用好這一豐富的天然資源。

References)

Bao SY，Wu SY，Li CP，et al.Study on preparation technology of silkworm pupa chitin［J］.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2012，23 (3):697-698.［包淑云，吳少云，李朝品，等.蠶蛹甲殼素的制備工藝研究［J］.時珍國醫國藥，2012，23 (3):697-698］

Chen YQ.Method and Technique of Biochemical Experiment ［M］.Beijing:Science Press，2002，166-168.［陳毓荃.生物化學實驗方法和技術［M］.北京:科學出版社，2002，166-168］

Duan YF，He ZC，Zhuang GD，et al.Study on the new production process of chitin［J］.The Food Industry，2007，28 (3):7-8，10.［段元斐，何忠誠，莊桂東，等.甲殼素提取新工藝的研究［J］.食品工業，2007，28 (3):7-8，10］

Guo BH.Chitin Extraction from Four Spieces of Insects and Purification of Insect Chitosan and Carboxymethyl chitosan ［D］.Beijing:China Academy of Forestry，2005.［郭寶華.四種昆蟲甲殼素的提取及昆蟲殼聚糖和羧甲基殼聚糖的制備［D］.北京:中國林業科學研究院，2005］

Guo CJ，Zhang HP，Zhang LR，et al.The investigation of potato diseases and pests in central and southern Ningxia ［J］.China Vegetables，2012，(13):30-32.［郭成瑾，張華普，張麗榮，等.寧夏中南部地區馬鈴薯病蟲害調查［J］.中國蔬菜，2012(13):30-32］

He LZ，Yang D，Liu Y，et al.Study on the preparation of chitin with EDTA decalcify method ［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2008，27 (4):49-52.［何蘭珍，楊丹，劉毅，等.制備甲殼素過程中EDTA 脫鈣法的研究［J］.食品與生物技術學報，2008，27 (4):49-52］

He YC，Xu QQ，Xu YH，et al.Extracting chitin and chitosan from Aspergillus Niger［J］.Biotechnology，2000，10 (2):20-22.［賀淹才，許慶清，許嫣紅，等.從黑曲霉提取甲殼素和殼聚糖［J］.生物技術，2000，10 (2):20-22］

Ji HJ，Ma YL.Study on pupa chitin extraction process［J］.Journal of Jilin Institute of Chemical Technology，2012，29 (5):28-32.［吉惠杰，馬艷麗.蠶蛹甲殼素提取工藝研究［J］.吉林化工學院學報，2012，29 (5):28-32］

Li WL，Lin NY，Li WP，et al.Study on the extraction of chitin from a new subspecies Blaps japanensis yunnanensis Mars［J］.Journal of Yunnan University (Natural Science Edition)，1999，21 (2):139-140.［李維莉，林南英，李文鵬，等.從云南琵琶甲中提取甲殼素的研究［J］.云南大學學報 (自然科學版)，1999，21 (2):139-140］

Liu GQ，Liu WX，Wei MC，et al.A preliminary study on the extraction of chitin from pupa of Dendrolimus punctatus ［J］.Journal of Northwest Forestry University，2007，22 (2):138-141.［劉高強，劉衛星，魏美才，等.從害蟲馬尾松毛蟲中提取甲殼素的初步研究［J］.西北林學院學報，2007，22 (2):138-141］

Liu XM，Wu N.Community features of Scarabaeoidea larvae in Stipa grandis steppe［J］.Chinese Journal of Applied Ecology，2004，15 (9):1607-1610.［劉新民，烏寧.大針茅草原蠐螬群落特征研究［J］.應用生態學報，2004，15 (9):1607-1610］

Peng YH，Huang C，Zhao ZJ.Study on optimization of ultrasonic wave-assisted extraction of chitin from shrimp shell［J］.Science and Technology of Food Industry，2012，9:304-306.［彭元懷，黃川，趙澤潔.超聲波輔助提取蝦殼甲殼素的工藝研究［J］.食品工業科技，2012，9:304-306］

Qu MJ，Jiang XJ，Ju Q，et al.Control and residual effects of several insecticides against the peanut grubs［J］.Plant Protection，2011，27 (2):167-169.［曲明靜，姜曉靜，鞠倩，等.4種殺蟲劑對花生蠐螬的防治效果及農藥殘留研究［J］.植物保護，2011，27 (2):167-169］

Shi LM，Wang HJ，Gao WB.Adsorption behavior of chitin for lead (II)［J］.Chemical Research and Application，2013，25 (3):336-339.［施林妹，王惠君，高偉彪.甲殼素對鉛(Ⅱ)的吸附研究［J］.化學研究與應用，2013，25 (3):336-339］

Tang YB，Xie J.Utilization of malate acid for the decalcifying of the shrimp head and shell ［J］.Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition)，2012，41 (3):311-314.［唐義寶，謝晶.蘋果酸用于蝦頭、蝦殼脫鈣的工藝條件［J］.福建農林大學學報 (自然科學版)，2012，41 (3):311-314］

Wang D，Hu JJ，Liu MT.The study of isolation chitin and chitosan from dung beetle［J］.Scientia Silvae Sinicae，2004，40 (5):180-185.［王敦，胡景江，劉銘湯.從臭蜣螂中提取甲殼素/殼聚糖的研究［J］.林業科學，2004，40 (5):180-185］

Wang JH，Gan X.Development and application of the silkworm chrysalis with plain crust［J］.Modern Business Trade Industry，2003，4:46-48.［王金華，干信.蠶蛹甲殼素的開發與應用［J］.現代商貿工業，2003，4:46-48］

Wang Y，Yang BB，Shao QJ.Progress in research on the effects of chitin，chitosan on immunologic function of aquatic animal［J］.China Feed，2013，(6):38-40.［王月，楊彬彬，邵慶均.甲殼素、殼聚糖對水產動物免疫功能的影響研究進展［J］.中國飼料，2013，(6):38-40］

Wu N，Liu XM，Guo L，et al.Influence of different stocking rates on scarabaoidea larvae community in inner mongolia typical steppe［J］.Journal of Inner Mongolia Normal University (Natural Science Edition)，2002，31 (4):379-383.［烏寧，劉新民，郭礪，等.不同放牧強度對內蒙古典型草原蠐螬群落特征影響的研究［J］.內蒙古師范大學學報 (自然科學版)，2002，31 (4):379-383］

Yang FW，Chen XM.Infrared spectroscopy and application performance comparison of several medical chitin non-woven［J］.Guangdong Chemical Industry，2012，39 (16):32.［陽范文，陳曉明.幾種醫用甲殼素無紡布的紅外光譜分析和應用性能比較［J］.廣東化工，2012，39 (16):32］

Zhang LL，Wu JX，Lu JJ.Scarabs species trapped by black light and population dynamics of dominant species in Yangling，Shaanxi Province ［J］.Journal of Environmental Entomology，2012，34 (3):395-399.［張林林，仵均祥，陸俊嬌.陜西楊凌地區黑光燈下金龜甲種類組成及優勢種群發生動態［J］.環境昆蟲學報，2012，34 (3):395-399］

Zhang X，Wang XT.Study on the preparation of chitin from exoskeleton of small lobsters［J］.Science and Technology of Cereals，Oils and Foods，2007，15 (4):36-37，48.［張雪，王雪濤.蝦殼制備甲殼素工藝研究［J］.糧油食品科技，2007，15 (4):36-37，48］

Zhang YW.Identification of two species of the genus Trematodes Fald.(Melolonthidae)［J］.Acta Zootaxonomica Sinica，1979，4 (3):303.［章有為.黑皺鰓金龜和爬皺鰓金龜的識別［J］.動物分類學報，1979，4 (3):303］

Zhou XC，Liu BQ，Guo CP，et al.Fermentation of lactobacillus used for clean production of chitin based on shellfish waste as material［J］.Oceanologia et Limnologia Sinica，2008，39 (5):517-522.［周湘池，劉必謙，郭春蘋，等.生物技術清潔生產替代高污染化學法制備甲殼素的研究與應用［J］.海洋與湖沼，2008，39 (5):517-522］