亞洲玉米螟幾丁質合成酶B (CHSB)啟動子序列克隆與分析

楊 晨 ，魯 新，王振營，席景會，潘怡歐，畢 銳，彭天飛，尚慶利*

(1.吉林大學植物科學學院，長春 130062;2.吉林省農業科學院植物保護研究所，吉林公主嶺 136100;3.中國農業科學院植物保護研究所，北京 100186)

亞洲玉米螟是一種主要為害玉米的重要的農業害蟲，主要分布在亞洲東部和澳洲(王振營等，2000)。其環境適應性強，生活的緯度跨越大，能夠適應從潮濕到干旱、寒冷到炎熱的絕大部分地區。因為寄主不同和生活的環境不同，亞洲玉米螟相應的生長狀態，如體重、大小、年發生代數都不盡相同(杜益哉和楊顧新，1985;謝為民，1989;胡明峻和孫伯欣，1979)。在我國，亞洲玉米螟主要分布在北至黑龍江，南至廣東的廣大區域。亞洲玉米螟寄主極為廣泛，除取食玉米外，還侵害包括常見的農作物有水稻、棉花、高粱、谷子等幾十種不同的農作物(王振營等，2000)。防治亞洲玉米螟通常采用化學農藥、選育抗性品種和天敵防治的方法。近年來，生物技術得到長足發展，也為玉米抗螟品種的培育提供了新的方法。例如將Bt 毒蛋白基因和蛋白酶抑制劑基因轉入玉米從而分別得到轉基因作物(丁群星等，1993;王國英等，1995)。但推廣轉基因作物困難重重，再加上傳統化學防治的過程中，亞洲玉米螟又會不斷的產生抗性。因此，亟待尋找一種新型的環境友好型的防治亞洲玉米螟的方法。昆蟲幾丁質合成酶是昆蟲蛻皮和變態發育過程中幾丁質生物合成的關鍵酶，同時也是潛在的環境友好殺蟲劑的理想靶標。

幾丁質是一種由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)以β-1，4 糖苷鍵連接而成的線性多糖。幾丁質在真菌、線蟲和節肢動物中都有發現，而昆蟲幾丁質是昆蟲體壁與中腸的圍食膜的重要組成成分，圍食膜可以保護昆蟲減少食物以及入侵微生物對中腸造成的機械損害(Hegedus et al.，2009)。

幾丁質的形成大致可分為三個不同的步驟(Merzendorfer，2006)。在第一步驟中，酶催化結構域形成聚合物;第二個步驟，新生的聚合物通過膜轉移并釋放到細胞外空間;最后一步完成單聚合物自發組裝形成結晶微纖維。在隨后的反應中微纖維與其他糖類、蛋白質、糖蛋白結合形成真菌隔膜和細胞壁以及節肢動物的角質層和圍食基質。這個過程在甲殼綱動物和昆蟲中最為常見。幾丁質合成酶與幾丁質的合成密切相關，它屬于糖基轉移酶的第二家族。幾丁質的合成需要UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)作為底物和二價陽離子作為輔因子。迄今為止，已發現的幾丁質合成酶共有兩種，它們分別是幾丁質合成酶A (CHSA)、幾丁質合成酶B (CHSB)(Merzendorfer，2006)。這兩種酶的基本屬性非常相似，分子量都在170 kDa 左右，都包含有3 個結構域:N-末端跨膜結構域，一個中央催化結構域和C-末端跨膜結構域。不同之處在于，CHSB 比CHSA 略短，具有較低的等電點，因此編碼的蛋白質也略小一些。它們功能表達的區域也并不相同，CHSA 主要合成昆蟲表皮的幾丁質(Arakane et al.，2008)，而CHSB 在圍食膜的形成階段表達(Arakane et al.，2005;Bolognesi et al.，2005;Kumar et al.，2008)。實驗證明，當抑制CHSB 合成幾丁質的表達時，昆蟲將會因為饑餓而導致死亡(Arakane et al.，2005)。本研究考慮通過研究CHSB 基因的啟動子，找出控制亞洲玉米螟中腸圍食膜幾丁質合成酶表達的核心元件，并分析該基因可能的轉錄調控途徑，尋找可能的靶點。

1 材料與方法

1.1 試蟲

收集實驗室人工飼養的亞洲玉米螟3 齡幼蟲，經液氮處理后凍入-80℃冰箱。

1.2 亞洲玉米螟基因組DNA 的提取以及前期準備

利用DNAiso Reagent (TaKaRa)試劑盒提取亞洲玉米螟基因組DNA。用6種不同的平末端內切酶(BstZ17I、PmeI、PsiI、PvuII、SmaI、SnaBI、StuI)分別消化基因組DNA。然后，再將消化后的片段按照DNA Genome WalkerTMUniversal Kit (Clonech)的步驟進行純化。最后，我們將已純化的DNA 片段分別連接上接頭引物。

1.3 染色體步移引物的設計及目的片段的PCR擴增

依據亞洲玉米螟 B 型幾丁質合成酶(OfCHSB)序列(GeneBank ID:DQ 294306)設計兩個反 特異性 物 GSP1 (5'-GTGATGAAGAGCAGGGTGCCTTTACA-3') 和GSP2 (5'-TTTCAGTATCGGATTCATCGCTGTCAC-3')，分別與用引 AP1 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3')、AP2 (5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3')配對使用。染色體步移總共需要進行兩輪PCR 反應，以AP1、GSP1為引物進行第一輪PCR，然后以第一輪PCR 產物稀釋50 倍為模板，AP2、GSP2 為引物進行第二輪特異性PCR 擴增。PCR 程序參考試劑盒說明書。

1.4 目的DNA 的pGEM-Teasy 載體連接與轉化

以不同內切酶處理獲得的DNA 為模板進行PCR 擴增并回收目的片段，回收產物與pGEM-Teasy 載體連接、轉化。選取陽性單克隆37℃擴大培養，并提取質粒進行測序。

2 結果與分析

2.1 染色體步移法擴增未知序列

用設計好的特異引物和處理好的玉米螟DNA進行兩輪特異性PCR，目的產物被特異性擴增。第二輪PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，只有經過平末端內切酶BstZ17I 處理后的DNA 片段經PCR擴增后，在1 kb 和2 kb 之間得到一條特異性條帶(圖1)。測序結果顯示該DNA 片段為OfCHSB 基因5'端側翼序列。

圖1 染色體步移法第二輪PCR 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis of the second round PCR of genome walker

2.1 OfCHSB 啟動子序列及分析

用啟動子分析軟件 (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分析了啟動子的核心元件及可能的轉錄因子結合位點。利用在線軟件(http://www.fruitfly.org/seq_ tools/promoter.html)預測轉錄起始位點。在序列表中，轉錄起始位點的堿基用+1 示出，起始密碼子ATG 用加粗標注。測序結果顯示，從BstZ17I 消化后的DNA 中擴增得到1484 bp 的DNA 片段，分析顯示該片段為OfCHSB 基因5'端序列。其中，OfCHSB 的開放閱讀框從+348 開始，啟動子包含的序列是﹣1082 至+347，轉錄起始位點從+1 開始。如圖所示，通過分析顯示6種轉錄因子(GATA-1、C/EBPalpha、Oct-1、Dfd、CREB、ER)可能參與OfCHSB 的轉錄調控，其在DNA 上的結合位點如圖所標示。+116 至+127 (CREB)、+120至+131 (ER)和+292 至+302 (Oct-1)區域可能是該啟動子的核心順式元件。

DNA 序列區域+348 至+402 (粗體)是OfCHSB 基因5'端的編碼區，-1082 至+1 是OfCHSB 基因啟動子序列。+1 表示OfCHSB 的轉錄起始位點，標注有下劃線的序列是可能的啟動子上的順式元件(見圖2)。

3 結論與討論

亞洲玉米螟幾丁質合成酶的研究中，CHSA 很可能存在兩個通過選擇性剪接的異構體，即OfCHSA-2a 和OfCHSA-2b (Qu and Yang，2011)，它們分別受兩個獨立的啟動子控制。其中OfCHSA-2a 在玉米螟生長和發展階段起作用，主要是在幼蟲-幼蟲蛻皮和幼蟲-蛹轉化，以及在產卵期間表達，而OfCHSA-2b 僅在幼蟲-幼蟲蛻皮時表達。由此可見啟動子對昆蟲幾丁質合成酶的產生有很大的影響。

在昆蟲生長的不同時期，產生幾丁質合成酶的過程受到啟動子的調控。CHSB 在圍食膜的形成階段表達 (Arakane et al.，2005;Kumar et al.，2008)。當抑制CHSB 合成幾丁質的表達時，昆蟲將會因為饑餓而導致死亡(Arakane et al.，2005)。假如能夠找出控制昆蟲生長發育過程當中至關重要的基因上的啟動子中核心元件，就有可能找到一種抑制該啟動子活性的安全快捷的方法，從而為開發基于該策略的亞洲玉米螟防治新方法提供理論基礎。實驗中，我們用染色體步移方法得到了全長接近1500 bp 的OfCHSB 5'端側翼序列，預測了OfCHSB 的轉錄起始位點并分析了該基因啟動子的核心元件及可能的轉錄因子結合位點。分析顯示6種轉錄因子(GATA-1、C/EBPalpha、Oct-1、Dfd、CREB、ER)可能參與OfCHSB 的轉錄調控。在家蠶BmUSP 基因中，轉錄因子Dfd 能夠調控該基因合成蛻皮激素，從而對家蠶的發育產生影響(Huang et al.，2014)。CREB 是一種亮氨酸拉鏈因子(bZIP)，亮氨酸拉鏈是蛋白質中一種常見的三維結構模體，常見于許多轉錄因子的DNA 結合結構域，因此涉及基因的表達調控。研究表明，在果蠅Myc 基因中的CREB 能夠調控該基因表達起到抑制多聚谷氨酰胺蛋白的毒性的作用，并可以被用來作為一種潛在的藥物靶標作用于多聚谷氨酰胺疾病(Singh et al.，2014)。ER 是鋅指蛋白(Zinc finger)的一種，鋅指是在很多蛋白中存在的一類具有指狀的結構模體，這些具有鋅指結構的蛋白大多都是與基因表達的調控有關的功能蛋白。在對東亞飛蝗的研究中，存在于LmSPC1 基因上的ER I 型信號肽酶亞基對東亞飛蝗的生存至關重要，影響其蛻皮、取食、生殖和胚胎發育等諸多方面。因此，該ER 轉錄因子能夠調控LmSPC1 基因的表達(Zhang et al.，2014)。Oct-1 是含有POU 結合域的一種轉錄因子并參與目的基因的轉錄調控。研究發現，同屬于POU 結構域的兩個同源異構型轉錄因子Oct-1 和Oct-2 能夠轉錄調控雞免疫球蛋白基因的表達，從而影響其免疫功能 (Petryniak et al.，1990)。結合Dfd、CREB、ER、Oct-1 在不同生物體中對相關基因發揮的轉錄調控作用，我們可以推測在亞洲玉米螟OfCHSB 基因中，這些結合位點同樣可能起著轉錄調控的作用。對該啟動子序列分析表明，該序列包含了完整的啟動子序列和OfCHSB 序列5' 端的一段序列，這是一個新的亞洲玉米螟OfCHSB 的啟動子序列。曾有研究人員獲得了約500 bp 的亞洲玉米螟OfCHSB 啟動子序列(Qu et al.，2011)，但與本研究得到的啟動子序列并不完全一致，這有可能是編碼同一種蛋白的不同拷貝型。基于這段完整的啟動子序列和預測得到的啟動子核心元件，我們可以進一步進行該序列的功能驗證并找出其調控途徑，從而為亞洲玉米螟的防治提供理論依據。

圖2 OfCHSB 基因啟動子和部分5' 端的編碼區序列Fig.2 OfCHSB promoter and part of the 5 ' end of the coding sequence

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