溝眶象體內感染的Wolbachia 的wsp 基因克隆與序列分析

高 朋，劉振凱，溫俊寶

(北京林業大學林木有害生物防治北京市重點實驗室，北京 100083)

Wolbachia 是廣泛分布于昆蟲細胞內的一類細胞內共生菌(Werren et al.，2008)。在16%的昆蟲體內檢測到Wolbachia 的存在，其中包括鞘翅目、雙翅目、半翅目、鱗翅目、直翅目及膜翅目(Werren et al.，1995;West et al.，1998)。通過長PCR 擴增檢測發現76%的節肢動物感染Wolbachia(Jeyaprakash et al.，2000)。說明Wolbachia 可能是現已發現的共生細菌中感染寄主最為豐富的類群。Wolbachia 對寄主昆蟲的主要影響有孤雌生殖、細胞質不親和、雌性化、殺雄作用。基于Wolbachia的對寄主昆蟲的這些影響，國內外開展了大量相關研究，主要集中在分類地位(van Meer et al.，1999;Jeyaprakash et al.，2000)，感染率(馮宏祖等，2014)，生殖調 控 (陸明紅，2011)，Wolbachia 的多重感染(李菁等，2010)等方面。

目前對于Wolbachia 的系統發育分析主要通過wsp、ftsZ、16S rDNA、gltA、groEL 等基因進行。Wolbachia 的系統發育分析早期主要通過16S rDNA基因進行，并對Wolbachia 進行分類，隨后的研究表明16S rDNA 基因的進化速度比較慢，不適用于Wolbachia 的多樣性進行精細的分類研究(Stouthmaer et al.，1993)。逐漸采 ftsZ 對Wolbachia 進行系統發育研究，因為其進化較快(Schilhutizen et al.，1998)。基于ftsZ 的系統發育研究，Wolbachia 可分為A-F 的6 個組 (Lo et al.，2002)。昆蟲感染的Wolbachia 主要屬于A 組和B 組，并通過wsp 基因將A 組和B 組進行了細分。Zhou 等 (1998)認為A 組包括Mel、AlbA、Riv、Mors、Uni、Pap、Haw 和Aus 8 個亞群，B 組包括Dei、Con、Pip 和CauB 4 個亞群。通過進一步 究 van Meer 等 (1999) 和Jeyaprakash 等(2000)將A、B 群進進一步細分為10 亞群、11 亞群。

溝眶象Eucryptorrhynchus chinensis (Olivier)主要危害臭椿樹Ailanthus altissima (Mill.)及其變種千頭椿Ailanthus altissima var.qiantouchun (楊貴軍等，2008)。在中國北方城市臭椿樹作為常用的行道樹，伴隨著種植面積的擴大，近年來溝眶象的危害越來越嚴重。目前對溝眶象的生物學特性和生理生化等方面已經進行了較多研究(雍惠莉等，2007;楊貴軍等，2008)。溝眶象幼蟲主要在地面以下活動，危害臭椿的根部，化學防治存在一定困難(于倩倩等，2012)。Wolbachia 能調控昆蟲的生殖，對溝眶象的防治可能存在一定幫助。目前尚無有關溝眶象體內Wolbachia 的報道。本文對溝眶象是否感染 Wolbachia;如果感染Wolbachia，對感染的Wolbachia 的分類地位，通過wsp 基因進行判斷和分析，為進一步研究Wolbachia對溝眶象生殖的調控提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

溝眶象分別采集于寧夏靈武、中寧、中衛，山東聊城，安徽淮北。所有樣本均用95%酒精保存，置于-20℃待用。

1.2 試劑

基因組DNA 提取試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，DNA 克隆試劑盒及PCR 所用的各種試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。試驗中所使用引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.3 溝眶象DNA 總提

分別采用單頭相應試蟲，利用基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑盒加入GA 緩沖液充分研磨，使昆蟲組織破碎，配置成細胞懸浮液，提取試驗用蟲的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性。將DNA 模板置于-20℃冰箱中保存備用。

1.4 溝眶象體內的Wolbachia 的wsp 基因的擴增

擴增使用Wolbachia 的wsp 基因片段的通用引物81F (5'-TGGTCCAATAAGTGAT GAAGAAAC-3')和691R (5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3')(Zhou 等，1998)。PCR 反應體系體積為25 μL，其中2×Power Taq PCR MasterMix (北京天)12.5 μL，DNA 模板1 μL，10 nmol/L 上下游引物各1 μL，滅菌水9.5 μL。PCR 擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性45 s，48℃退火45 s，72℃延伸45 s，35 個循環;最后72℃總延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠檢測PCR 擴增產物。

1.5 序列測定與分析

將目的基因wsp 片段的PCR 產物回收、純化，然后與pGM-T 載體連接，再轉化到感受態大腸桿菌TOP-10 菌株中，篩選陽性克隆，隨機挑選3 個克隆，委托北京擎科生物技術有限公司進行雙向測序。每個種群隨機選取20 個個體對其體內的Wolbachia 進行檢測，然后對wsp 基因進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 總提DNA 的檢測

溝眶象的總提DNA 通過1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 進行檢測，DNA 條帶清晰，無拖尾彌散現象，OD260/OD280均在1.8 左右。表明DNA 純度較高，可用克隆與檢測。

2.2 溝眶象體內Wolbachia 的感染情況

通過使用Wolbachia 的wsp 基因通用引物對5 個種群的個體的腹部總提NDA 進行擴增檢測，結果發現每個種群每個個體都都擴增出一條593 bp 的片段，證實了溝眶象每個種群都感染了Wolbachia，而且感染率為100% (表1)。

表1 溝眶象5 個地理種群的Wolbachia 檢測Table 1 Wolbachia infection of five populations of Eucryptorrhynchus chinensis

2.3 溝眶象體內Wolbachia 的wsp 基因序列分析

根據克隆測序結果得知，擴增出的片段大小為593 bp，各種堿基含量:190T (32.0%)、90C(15.2%)、180A (30.4%)、133G (22.4)。獲得序列A+T 的含量為62.4%，A +T 含量明顯高于G+C 含量(37.6%)，與其它昆蟲相似。將獲得基因在NCBI 上進行比對，與其他Wolbachia 的wsp基因同源性很高，確定為wsp 基因。該基因序列已提交到GenBank (登錄號為KP713759)。

2.4 溝眶象體內Wolbachia 的wsp 基因的同源性分析

Wsp 同源性分析主要參照A.Jeyaprakash 在2000年提出的A、B 群分類方法，其中A 群分為10 個亞群，B 群分為11 亞群。從NCBI 中下載van Meer 等(1999)和Jeyaprakash 等(2000)分類中所用的38 條Wolbachia 的wsp 基因序列片段(表2)，及本文獲得溝眶象體內的wsp 基因片段，使用MEGA 6.0 建立了NJ 系統發育樹，其中各分支的置信度用1000 次自導復制來評價。根據wsp 基因同源性，通過NJ 系統發育樹分析，得出溝眶象體內的Wolbachia 屬于A 群Dro 亞群(圖1)。溝眶象體內的Wolbachia 與同屬Dro 亞群的Trichopria drosophilae 體內的Wolbachia 菌株在61、64、68、81、363 處有堿基A 和堿基C 的置換，在117、132、150、159 處有堿基T 和堿基C 的置換，在67、84、85、168 有堿基A 和堿基G 的置換，在70 處有堿基A 和堿基T 的置換，在153 有堿基A和堿基G 的置換，在346 處有堿基C 和堿基G 的置換。

表2 用于構建Wolbachia 系發育統樹的wsp 基因序列信息Table 2 The information of wsp gene for contracting the phylogenetic tree of Wolbachia strains

(續上表)

圖1 溝眶象感染的Wolbachia 的分類地位Fig.1 The classification status of Wolbachia infection Eucryptorrhynchus chinensis

3 結論與討論

本文對溝眶象的5 個地理種群進行了隨機抽樣檢測，發現5 個地理種群的感染率均為100%。相關的報道中，也曾出現昆蟲的一些地理種群Wolbachia 感染達到100%的情況，但很少出現多個地理種群感染率均100%的情況，一般各個地理種群間都存在一定的差別(馮宏祖等，2014)。本文檢測的所有個體均受到Wolbachia 感染，推測Wolbachia 對溝眶象的感染率100%。但本文所采樣本及地理種群數較少，要證實推測需要增加地理種群數和樣本量。

Wolbachia 存在水平傳播的現象，其中一種是Wolbachia 在昆蟲與其他節肢動物間的水平傳播。溝眶象的Wolbachia 感染率高達100%，有可能是寄生在臭椿樹的其他節肢動物水平傳播所致，而且對臭椿樹上的另一種害蟲臭椿溝眶象也進行了檢測，檢測到其體內有相同的 wsp 基因的Wolbachia 菌株。Wolbachia 是否在二者之間發生了水平傳播，需要進一步證明。

本文獲得的溝眶象感染的Wolbachia 的wsp 基因片段長度為593 bp。與先前的報道中同樣使用wsp 通用引物(81F、691R)進行PCR 擴增后獲得片段長度存在差異。蝶蛹金小蜂 Pteromalus puparum 感染的Wolbachia 通過通用引物PCR 擴增后wsp 基因大小為540 bp (王歡等，2006)，蘋果蠹Cydia pomonella 蛾感染的Wolbachia 在PCR 擴增后獲得wsp 基因片段大小為617 bp (馮宏祖等，2014)。而本文獲得wsp 基因片段為593 bp，長度居中。溝眶象感染的Wolbachia 的wsp 基因片段與同屬 Dro 亞群的 Trichopria drosophilae 體內的Wolbachia 菌株長度相同，與其它亞群的wsp 基因長度存在較大差異。

調控寄主的生殖是Wolbachia 的一個重要作用，主要包括誘導雌性化、胞質不親和(CI)、誘導孤雌生殖、殺雄作用等。由于溝眶象幼蟲主要在臭椿根部取食，一般藥物防治很難達到效果。溝眶象體內Wolbachia 的感染率100%，目前其體內只檢測到1種Wolbachia。這種Wolbachia 屬于A 群Dro 亞群。同為Dro 亞群Trichopria drosophilae感染的Wolbachia 對寄主具有誘導CI 的能力(van Meer，1999)，據此推測溝眶象體內的Wolbachia也可能誘導CI 的作用。如果能利用其誘導溝眶象CI，可以作為一種有效的生物防治手段。

本文通過wsp 基因只檢測到1種Wolbachia，如果采用基于多個基因位點的MLST 分類系統(MultilocusSequence Typing System)可能會發現更多的Wolbachia 菌株，但MLST 的亞型分類尚不完善(李菁等，2010)。隨著技術的發展，使用MLST 分類系統在溝眶象體內可能會發現新的Wolbachia 菌株。

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