RGC-32和ZEB1在胃癌組織中的表達

夏祥偉，茅國新

(高郵市人民醫院，江蘇 揚州225600)

胃癌是消化系統常見惡性腫瘤，在我國及日本發病率、死亡率均較高，目前其發、發展的機制并不十分清楚。胃癌的發生、發展是一個多階段、多步驟的過程，主要機制包括原癌基因的激活、黏附機制的失調及抑癌基因的失活等。補體反應基因－ 32(response gene to complement-32，RGC-32)是一種新發現的補體激活基因，RGC-32 基因的表達異常會導致細胞轉化，在腫瘤轉移浸潤等過程中起關鍵作用［1］，現已發現在人類多種腫瘤組織中存在RGC-32 的異常表達。鋅指E 盒結合蛋白(zinc-finger E-box-binding homeobox factor 1，ZEB1)是鋅指結構轉錄因子家族的重要一員，是胚胎發育中關鍵轉錄因子，是細胞分化和胚胎發育的重要分子，ZEB1 在腫瘤發生、發展過程中起到重要作用。ZEBl 通過多種途徑抑制了E－鈣黏蛋白及其他相關蛋白的表達，增加多種腫瘤的侵襲和廣泛轉移的能力。本研究應用免疫組化S-P 法檢測RGC-32 及ZEB1 在胃癌、癌前病變及癌旁正常胃黏膜組織中的表達情況，并分析兩者與胃癌臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2011年1月至2013年12月高郵人民醫院收治的術后胃癌標本60 例、癌前病變組織60 例(來源胃鏡組織活檢)及癌旁正常胃黏膜組織20例。所有標本均具有完整的臨床及病理資料。胃癌患者術前均未接任何抗腫瘤治療。

1.2 方法 標本經過質量分數4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 切片，然后采用免疫組化S-P 法進行RGC-32 和ZEB1 的表達，所用一抗為兔抗人RGC-32和ZEB1 抗體，操作按照說明進行，用已知RGC-32 和ZEB1 陽性組織作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果評判標準 雙盲法隨機計數1 000 個細胞，計算出陽性細胞所占比例，陽性反應程度根據陽性細胞所占比例進行分級。

RGC-32 陽性信號表現為棕黃色，主要位于細胞膜、細胞質中，以陽性細胞的所占比例為標準:每張組織切片隨機抽取10 個視野，每個視野觀察100 個細胞，記錄染色為陽性的細胞數，最后結果取各組的平均值，陽性細胞所占的比例換算百分率:0 ～5%為陰性(－)，＞5% ～25%為弱陽性(+)、＞25% ～50%為中等陽性(+ +)、＞50%為強陽性(+ + +)，其中強陽性、中等陽性歸為陽性表達，而弱陽性、陰性歸為陰性表達。

ZEB1 陽性信號為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細胞核和細胞質，以陽性細胞所占比例為標準:每張切片隨機抽取10 個視野，每個視野觀察100 個細胞，計算染色為陽性的細胞數，最后結果取各組的平均值，陽性細胞所占的比例換算百分率:0 ～5% 為陰性(－)，＞5% ～25%為弱陽性(+)、＞25% ～50%為中等陽性(+ +)、＞50%為強陽性(+ + +)，其中強陽性、中等陽性歸為陽性表達，而弱陽性、陰性歸為陰性表達。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0 對數據進行分析，應用χ2檢驗對RGC-32 和ZEB1 在胃癌、癌前病變和正常胃黏膜組織中的表達以及兩者與胃癌各臨床病理特征間的關系進行分析，采用χ2檢驗及Spearman 等級相關檢驗對兩者在胃癌組織中的相關性進行分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 RGC-32 在不同胃組織中的表達 60 例胃癌組織中47 例陽性表達(78.3%)，60 例癌前病變組織中25 例陽性表達(41.7%)，20 例正常胃黏膜組織中8例陽性表達(40.0%)(χ2=19.269，P ＜0.001)，提示胃癌、癌前病變和正常胃黏膜組織中RGC-32 蛋白陽性表達率逐漸降低。見圖1、表1。

2.2 ZEB1 在胃癌、癌前病變及正常胃黏膜中的表達60 例胃癌組織中陽性表達53 例(88.3%)，60 例癌前病變組織中陽性表達30 例(50.0%)，20 例正常胃黏膜組織中4 例表達陽性(20.0%)(χ2=36.354，P ＜0.001)，提示胃癌、癌前病變和正常胃黏膜中的ZEB1蛋白陽性表達率逐漸降低。見圖2、表1。

圖1 RGC-32 在不同胃組織中的表達(S-P，×400)

圖2 ZEB1 在不同胃組織中的表達(S-P，×400)

表1 RGC-32 和ZEB1 在不同胃組織中的表達

2.3 胃癌組織中RGC-32 和ZEB1 的表達與起臨床病理特征之間的關系 胃癌組織中RGC-32 和ZEB1的表達與胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴結轉移有關(P ＜0.05)。見表2。

2.4 不同胃組織中RGC-32 和ZEB1 表達的相關性胃癌組織中RGC-32、ZEB1 同時陽性47 例，同時陰性7 例，RGC-32 陽性而ZEB 陰性0 例，RGC-32 陰性而ZEB1 陽性6 例。統計分析結果顯示，RGC-32 和ZEB1 在胃癌組織中的表達呈正相關(r =0.568，P ＜0.001)。

癌前病變組織中RGC-32 和ZEB1 同時陽性20例，同時陰性25 例，RGC-32 陽性而ZEB1 陰性5 例，RGC-32 陰性而ZEB1 陽性10 例。統計分析結果顯示，RGC-32 和ZEB1 在癌前病變組織中的表達呈正相關(r=0.452，P ＜0.001)。

正常胃黏膜組織中RGC-32 和ZEB1 同時陽性3例，同時陰性11 例，RGC-32 陽性而ZEB1 陰性5 例，RGC-32 陰性而ZEB1 陽性1 例。統計分析結果顯示，RGC-32 和ZEB1 在正常胃黏膜組織中的表達無明顯相關(r=0.336，P=0.110)。

3 討論

胃癌是我國發病率、死亡率較高的惡性腫瘤之一，但是其發生、發展的機制目前并不十分清楚。RGC-32是一種新發現的補體激活基因，RGC-32 基因的異常表達會促進細胞轉化，RGC-32 的異常表達在人類多種腫瘤組織中。RGC-32 在腫瘤發生、發展中的作用不明確，更多的研究尋找其在腫瘤發生、發展過程中的作用。ZEB1 可以降低IL-2、p73、GATA-3、collagenI/Ⅱ等基因的表達，并可通過負性調控E－鈣黏蛋白的表 達，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移。

表2 胃癌組織中RGC-32、ZEB1 表達與其臨床病理學特征之間的關系

人類RGC-32 基因位于13q14.11，與白鼠類RGC-32 蛋白具有92%的同源性［1－2］，RGC-32 表達在人類多種組織和器官中，參與多種細胞生物學過程，是新發現的補體激活基因［3－5］。RGC-32 在不同腫瘤中的作用各異，在腫瘤發生、發展中的作用及機制不明確。Zhu 等［6］研究報道，RGC-32 在胰腺癌組織中的表達明顯高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織，同時發現其表達與淋巴結轉移及TNM 分期有關(P 均＜0.05)，認為RGC-32 是胰腺癌的轉移促進因子之一，在研究中還發現，胰腺癌組織中RGC-32 的陽性表達率和E－鈣黏蛋白的陽性表達率呈正相關(r =0.458，P ＜0.01)，猜測RGC-32 參與了胰腺癌的上皮間質轉化過程，從而促進其侵襲和轉移。Fosbrink 等［7］發現結腸癌組織中RCC-32 蛋白的表達上調更為顯著，他發現結腸癌組織中RGC-32 蛋白的表達水平明顯增高。Vlaicu 等［8］發現高表達RGC-32 與結直腸癌的轉移明顯相關。體外實驗［9］發現，上調的RGC-32 蛋白通過NF-κB 信號途徑促進肺癌細胞的侵襲和發生上皮間質轉化過程。研究［10］發現RGC-32 的過表達促進細胞骨架重組，有利于細胞運動，推測細胞骨架重組是RGC-32 促進腫瘤轉移的重要機制。

研究［6］發現:RGC-32 在胰腺癌、慢性胰腺炎及正常胰腺組織中均有表達，其表達于胰腺腺泡細胞的細胞質中，染色均一，呈棕褐色，RGC-32 在胰腺癌組織中的染色強度最強，陽性表達率高于慢性胰腺炎及正常胰腺組織。胃癌組織及正常胃組織中RGC-32 表達部位目前尚未見報道，研究顯示其在人類很多腫瘤中都有表達，然而其在腫瘤形成及發展中的作用機制仍存在爭議，一方面，有報道稱，在多發性骨髓瘤、子宮內膜癌、侵襲性前列腺癌等腫瘤組織中RGC-32 表達下降，提示其為抑癌基因［4］;另一方面，在胰腺癌、卵巢癌、結腸癌、乳癌等腫瘤組織中表達上調，提示為癌基因，體外研究證實RGC-32 在胰腺癌細胞介導TGF-β 誘導的上皮間質轉化和轉移，提示其為癌基因［6－7，11］。本研究發現:正常胃組織、癌前病變組織、胃癌組織中的RGC-32 陽性表達率逐漸增高，其可能參與了胃癌的發生、發展過程。RGC-32 蛋白的陽性表達與胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴結轉移有關(P 均＜0.05)，提示RGC-32 的表達參與了胃癌的發生、發展。

ZEB1 是鋅指結構轉錄因子家族的重要成員之一，也是胚胎發育中所必須的轉錄因子。ZEB1 是細胞分化和胚胎發育的關鍵影響因素，ZEB1 的表達在腫瘤生物學中起重要作用，抑制E－鈣黏蛋白表達，增加腫瘤的侵襲及轉移能力。ZEB1 在多種腫瘤組織中高表達，如乳腺癌、骨轉移性小細胞肺癌、肝癌等，且高表達預示著較差的預后。Jia 等［12］運用免疫組化S-P法分別檢測45 例胃癌、癌旁正常胃黏膜組織中ZEB1的表達，結果提示:胃癌組織中ZEB1 的陽性表達率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，進一步數據分析發現，ZEB1 蛋白的表達在低分化癌組織和TNM 高分期組織中明顯升高。本研究結果提示:正常胃黏膜組織、癌前病變組織、胃癌組織中的ZEB1 陽性表達率逐漸增高，說明ZEB1 可能參與了正常胃黏膜組織至胃癌的發生、發展演變過程。ZEB1 蛋白的陽性表達與胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴結轉移有關(P 均＜0.05)，提示ZEB1 的表達與胃癌的發生密切相關。RGC-32 與ZEB1 在胃癌中的關系目前尚未見報道，本研究發現兩者在胃癌組織、癌前病變組織中的表達呈正相關關系，提示RGC-32 和ZEB1 可能通過某個中間產物共同介導胃癌細胞的癌變、侵襲和轉移。

綜上所述，RGC-32 和ZEB1 與胃癌細胞的癌變、侵襲和轉移密切相關，聯合檢測RGC-32 和ZEB1 蛋白的表達，對胃癌的早期診斷及判斷腫瘤的惡性程度、預后有重要作用。探索以RGC-32 和ZEB1 為靶點的治療，為胃癌的治療提供一條新思路。但是，有關RGC-32 與ZEB1 在胃癌組織中的表達與臨床預后的具體關系有待進一步隨訪觀察。

［1］Badea TC，Niculescu FI，Soane L，et al.Molecular cloning and characterization of RGC-32，a novel gene induced by complement activation in oligodendrocytes［J］. J Biol Chem，1998，273 (41):26977－26981.

［2］Badea T，Niculescu F，Soane L，et al.RGC-32 increases p34CDC2 kinase activity and entry of aortic smooth muscle cells into S-phase［J］.J Biol Chem，2002，277(1):502－508.

［3］朱亮，趙秋，李德民，等.過表達RGC-32 對胰腺癌BxPC-3 細胞增殖、凋亡的影響［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2014，23(11):1347－1350.

［4］Vlaicu SI，Cudrici C，Ito T，et al.Role of response gene to complement 32 in diseases［J］.Arch Immunol Ther Exp (Warsz)，2008，56(2):115－122.

［5］Li F，Luo Z，Huang W，et al. Response gene to complement 32，a novel regulator for transforming growth factor-beta-induced smooth muscle differentiation of neural crest cells［J］.J Biol Chem，2007，282(14):10133－10137.

［6］Zhu L，Qin H，Li PY，et al. Response gene to complement-32 enhances metastatic phenotype by mediating transforming growth factor beta-induced epithelial-mesenchymal transition in human pancreatic cancer cell line BxPC-3［J］.J Exp Clin Cancer Res，2012，31:29.

［7］Fosbrink M，Cudrici C，Niculescu F，et al.Overexpression of RGC-32 in colon cancer and other tumors［J］.Exp Mol Pathol，2005，78(2):116－122.

［8］Vlaicu SI，Tegla CA，Cudrici CD，et al.Epigenetic modifications induced by RGC-32 in colon cancer［J］. Exp Mol Pathol，2010，88(1):67－76.

［9］Sun Q，Yao X，Ning Y，et al. Overexpression of response gene to complement 32 (RGC32)promotes cell invasion and induces epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cells via the NF-κB signaling pathway［J］.Tumour Biol，2013，34(5):2995－3002.

［10］田杰，徐川，楊敏慧，等. 補體應答基因-32 過表達對SW480 細胞骨架的影響［J］. 南方醫科大學學報，2011，31(7):1179－1182.

［11］Vlaicu SI，Cudrici C，Ito T，et al.Role of response gene to complement 32 in diseases［J］.Arch Immunol Ther Exp (Warsz)，2008，56(2):115－122.

［12］Jia B，Liu H，Kong Q，Li B.Overexpression of ZEB1 associated with metastasis and invasion in patients with gastric carcinoma［J］.Mol Cell Biochem，2012，366(1－2):223－229.