神經節苷脂誘導U251細胞內質網應激相關凋亡

王雪晶，丁雪冰，滕軍放，馬明明，王志紅

(1.鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州450052;2.河南省人民醫院神經內科，河南 鄭州450003;3.鄭州大學第二附屬醫院婦產科，河南 鄭州450014)

神經節苷脂(monosialotetrahexosy-1 ganglioside， GM1)是細胞膜的主要成分［1］。以往研究［2］發現外源性GM1 與脂蛋白結合，可通過血腦屏障進入中樞神經系統，參與神經修復及重構的病理生理過程。膠質瘤是常見的顱內原發腫瘤，至今為止沒有有效的治療手段。本課題組之前研究已證實GM1 通過上調巨自噬水平誘導了膠質瘤細胞的自噬性死亡，本研究進一步探討GM1 通過調控惡性腦膠質瘤細胞U251 內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導其凋亡的具體機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人腦星形膠質瘤細胞系U251 購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，常規培養于含體積分數12%胎牛血清的DMEM 完全培養基中，置于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養，每1 ～2 d 換液1 次。待細胞鋪滿培養瓶底90%后，以消化液(含質量分數0.3%胰蛋白酶和質量分數0.05%EDTA)消化，1∶4 比例傳代。

1.2 MTT 法檢測細胞存活率 U251 細胞接種于96孔板(密度為3 × 103/孔)，次日對照組給予常規DMEM 培養基，實驗組分為3 個濃度組，分別加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，每組設4 個復孔，培養48 h，棄培養基，每孔加10 μL MTT 和90 μL 無血清DMEM 培養基，37 ℃孵育2 h，加入150 μL DMSO 振蕩溶解，酶標儀于570 nm 波長處測量吸光度(A)值，細胞存活率(%)=實驗組A 值/對照組A 值×100%。

1. 3 LDH 釋放檢測 實驗組加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，培養48 h 后，收集細胞培養基，按照LDH 試劑盒說明操作并計算LDH 釋放率。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 實驗組加入0、100、250 μg·mL－1的GM1，48 h 后收集細胞，預冷1 ×PBS洗滌后棄去上清，重懸細胞于Annexin 結合緩沖液，每份標本容量為120 μL，加入8 μL Alexa Fluor 488 AnnexinⅤ和2 μL 100 μg·mL－1PI 工作液，室溫下孵育15 min，加入400 μL Annexin 結合緩沖液，在冰上輕輕混勻，立即用流式細胞儀檢測分析。

1.5 Western blot 法檢測蛋白表達 0、100、250 μg·mL－1的GM1 孵育48 h 后收集細胞，提取總蛋白并檢測。經SDS-PAGE 電泳，濕轉至PVDF 膜后封閉，加入抗CHOP(1 ∶500)、抗caspase-12(1 ∶500)抗體，4 ℃過夜。加入HRP 標記的二抗，孵育2 h，ECL 液顯色，膠片曝光，GAPDH 設為內參。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0 進行分析，計量資料用±s 表示，組間比較采用t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 GM1 對U251 細胞存活率的影響 MTT 法檢測結果顯示:0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 細胞存活率分別為(96. 0 ±4. 2)%、(74. 1 ±13.2)%、(59.2 ±10.3)%，與對照組比較差異有統計學意義(P 均＜0.05)，且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 GM1 對U251 細胞存活率的影響

2.2 GM1 對U251 細胞LDH 釋放率的影響 U251細胞經0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，收集培養上清液，按照LDH 試劑盒說明操作并計算LDH釋放率。LDH 釋放率(%)= 上清LDH/總LDH ×100%，以對照組為100%，實驗組與對照組比較。0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 細胞LDH釋放 率 為(100. 0 ± 6. 3)%、(140. 0 ± 15. 5)%、(172.0 ±11.3)%，與對照組比較差異有統計學意義(P 均＜0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 GM1 對U251 細胞LDH 釋放率的影響

2.3 GM1 對U251 細胞凋亡率的影響 0、100、250μg·mL－1GM1 作用48 h 后，U251 細胞凋亡率為(3.1±0.2)%、(16.0 ±1.9)%、(37.1 ±12.1)%，與對照組比較差異有統計學意義(P 均＜0.05)，且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 GM1 對U251 細胞凋亡率的影響

2.4 GM1 對U251 細胞CHOP、caspase-12 表達水平變化的影響 與對照組比較，0、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h 后，CHOP 表達水平明顯上調，且呈現劑量依賴性(P ＜0.05);caspase-12 活性片段表達水平明顯上調，且呈現劑量依賴性(P ＜0.05)。見圖4。

圖4 GM1 對CHOP 及caspase-12 表達水平的影響

3 討論

內質網是真核細胞的蛋白質翻譯后修飾、折疊和組裝的場所，當蛋白質相關修飾以及蛋白質由內質網向高爾基體轉運等過程受阻，或錯誤折疊的蛋白質在內質網大量蓄積則會損傷內質網的正常生理功能，稱為ERS［3］。ERS 主要激活3 條信號通路:未折疊蛋白反應、內質網相關蛋白降解功能和調節多肽進入內質網的蛋白質的翻譯過程的調控［3］。ERS 介導的細胞凋亡是一種新的凋亡途徑，與死亡受體途徑和線粒體途徑不同，ERS 誘導細胞凋亡過程更為復雜，主要通過3 種途徑:CHOP 途徑、ASK1-JND 途徑和caspase-12途徑［4］。ERS 是一種高度保守的細胞反應機制，適度的ERS 對細胞有保護作用，而過度的ERS 啟動了ERS相關凋亡過程。研究［5］表明，ERS 與腫瘤的發生、發展密切相關，而ERS 介導的腫瘤細胞凋亡是腫瘤細胞自然死亡的一種重要形式，這為腫瘤治療研究提供新方向。

根據糖基數目不同，GM 分為GM1(含4 個糖基)、GM2(含3 個糖基)和GM3(含2 個糖基)［6－7］。隨著研究的不斷深入，人們逐漸發現GM1 不緊參與調節胚胎發育、神經生長與修復等生理過程，也參與抑制了腫瘤的發生、發展及轉移等病理過程，但具體機制仍不明［8］。膠質瘤是原發于神經系統最常見的腫瘤之一，惡性膠質瘤預后差，平均生存周期不超過1 a［9］。手術是膠質瘤的主要治療方式，但術后易復發，各種單一的治療方案難以取得令人滿意的效果。因此，探索新的治療手段具有重要意義。本研究發現，隨著GM1 濃度的增加U251 細胞存活率明顯降低，細胞損傷增加，細胞凋亡率增加，呈現劑量依賴性。進一步研究證實，隨著GM1 濃度的增加可誘導U251 細胞ERS 相關通路CHOP/caspase-12 激活，從而誘發ERS 相關凋亡的啟動，導致U251 細胞的死亡。綜上所述，GM1 通過誘導ERS 相關凋亡抑制了U251 細胞的生長，促進人腦星形膠質瘤細胞凋亡過程，為GM1 治療惡性腦膠質瘤提供了新的理論依據。

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