微RNA的特征概述及其研究進展

鐘阿紅，張振宇(綜述)，余進進，吳亦波(審校)

(1.蘇州大學附屬第四醫院婦產科，江蘇無錫214062;2.江南大學附屬醫院無錫市第四人民醫院a.婦產科，b.生殖中心，江蘇 無錫214062)

微RNA(microRNA，miRNA)是一類由21～23個核苷酸組成的內源性、非編碼、單鏈小分子RNA，通過完全或不完全堿基互補配對原則與特定基因的信使RNA的3'-非翻譯區或5'-非翻譯區結合，在轉錄后水平通過對靶信使RNA降解或抑制翻譯過程而發揮負性調控作用。1993年，Lee等［1］通過對秀麗新小桿線蟲的研究首先報道了miRNA的存在。2000年，Reinhart等［2］在線蟲發育調控的研究中發現了第2個miRNA——let-7，從而拉開了對miRNA研究的序幕。自miRNA被發現以來，人們已經發現了數萬種miRNA，這一數字仍在不斷增加。相信隨著科學的進步，技術的發展，越來越多的未知miRNA將會被發現，同時也將會面臨新的挑戰。現就miRNA的特征及研究進展進行概述。

1 miRNA簡介

1.1 miRNA的命名 Sanger microRNA序列數據庫(miRBase)是一個提供包含miRNA的序列數據、miRNA的命名以及對miRNA靶基因預測的全方位數據庫。作為存儲miRNA信息的權威數據庫，miRBase具有對miRNA基因名稱獨立注冊的權利。早在miRNA被大規模發現的時候，其命名機制就被確定下來，當前已發展了一套成熟的miRNA命名系統［3］。目前，miRBase已于2014年6月升級至miRBase 21.0版。在該版本中，共收錄28 645個miRNA前體和35 828個成熟體miRNAs，涵蓋了223個物種。相比上一版本(miRBase 20.0版)，新版數據庫的可靠性進一步提升，清除了一些不明確的和錯誤注釋的序列，又有72個條目被清理出數據庫。miRNA的命名一般遵循以下基本規則:(1)miRNA的成熟體通常用miR表示，而miRNA的前體則用mir表示，然后是其物種名稱(采用3～4個字母的縮寫來表示)以及被發現的時間次序(一般使用阿拉伯數字表示，如hsa-miR-200，mmu-miR-200);(2)同源性較高的miRNA在數字后面加上英文小寫字母(a，b，c，…)，如 hsa-miR-200a、hsa-miR-200b 和has-miR-200c;(3)如果一個成熟的miRNA不是由同一條染色體上的DNA序列轉錄加工產生，則在后面加上阿拉伯數字以區別(如hsa-miR-16-1和hsa-miR-16-2);(4)若一個miRNA前體的兩個臂可以分別轉錄加工成 miRNA，則用“-5p”和“-3p”以區分，分別表示從該前體的5'端臂和3'端臂加工而來(如 hsa-miR-125a-5p和 has-miR-125a-3p)［3］。以前認為，這兩個miRNA表達水平有差異，將表達水平較低的miRNA在后面加上*號表示，而表達水平較高的miRNA后面則不加任何符號。并且一般認為miRNA*是沒有功能的，但是有研究報道miRNA*其實也是有功能的［4］，在某些組織里表達水平甚至高于miRNA［5］。自miRBase19.0版起，這種 miRNA*命名方式已經終止使用。另外，命名規則確定之前已經被發現的miRNA，如lin-4和let-7，則仍使用原來的名字。

1.2 miRNA的生物合成 miRNA的生物合成是一個相當復雜的生物學過程，它具有多個步驟。首先，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，核內編碼miRNA的基因轉錄為初級miRNA;隨后，經Drosha-DGCR(Drosha-DiGeorge syndrome critical region gene)8復合物的幫助，初級miRNA被剪接成長為70～80 nt的具有類似發夾樣結構的miRNA前體;接著，在核質(細胞質)轉運輸出蛋白5的參與作用下，miRNA前體被自細胞核轉運至細胞質中;然后，經核酸酶Dicer作用，miRNA前體被進一步剪切成長度約為22 nt的雙鏈RNA分子;最后，雙鏈RNA分子在解旋酶的酶解作用下，一條鏈被降解，另一條鏈則成為成熟的miRNA，并與Argonaute蛋白一起，與特異的RNA沉默復合物結合后形成特異的RNA沉默復合物-信使RNA復合物，再按照堿基互補原則與靶信使RNA結合，從而在轉錄后水平發揮相關負性調控作用。

1.3 miRNA的生物特性

1.3.1 高度的進化保守性 目前研究認為，成熟的miRNA在物種進化過程中具有一定的保守性，人們在低等生物和高等生物基因組中均可以找到同源miRNA，如人和靈長類動物的miRNA之間就有40%的同源基因［6］。miRNA序列結構上的這種高度保守性具有重要的生物學意義，提示可能在不同生物體的生長發育過程中，miRNA具有比較一致的表達調控機制，同時這也為生物進化的同源性提供了某種依據，對人們了解物種演變的過程具有非常重要的意義。

1.3.2 表達的空間特異性 miRNA只在特定的細胞或組織表達，如miR-124和miR-9在神經系統內高表達，但是兩者仍有區別，miR-124主要表達于神經前體細胞中，而miR-9則主要表達于神經元和膠質細胞中［7-10］。miRNA在不同組織間、細胞間的差異表達，向人們提示miRNA可能在生物體的組織或細胞分化過程中發揮了作用，也對人們理解生物體在正常和疾病狀態下miRNA表達的形式和水平的不同有一定的幫助。

1.3.3 表達的時間特異性 miRNA只在特定的時間或發育階段表達。如miR-1和let-7能在成年果蠅中表達，而未能在培養20～24 h的果蠅胚胎細胞中檢測到［3］。miRNA的表達呈現出時間發育特異性，提示miRNA可能參與了生物體個體的發育過程，并且極有可能在其中發揮了調控作用。

1.4 miRNA的功能 miRNA通常位于基因間隔區，但也有部分存在于遺傳編碼基因的內含子中［11］。它雖僅占人類基因總數的2%，卻調控著人類基因組中30%以上的基因，是基因調控網絡中的核心成分［12］。miRNA在生物體內廣泛存在，對包括生物體的細胞增殖、分化、凋亡和生物體個體的發育以及疾病的產生、進展及預后等生命活動均發揮著廣泛的生物學調控作用，故而對其進行深入研究具有非常重要的意義［13-14］。當今，miRNA已成為腫瘤研究領域中的熱點。Calin等［15］于2002年最先報道了miRNA在腫瘤發生中的作用。隨著研究的不斷深入，人們發現基因組的不穩定性是腫瘤的常見特征之一，約50%的miRNA基因位于與腫瘤相關的染色體的脆性位點上，而且不同類型的腫瘤具有明顯不同的miRNA表達譜［16］。miRNA具有類似癌基因或抑癌基因的功能，表現為癌基因的活化或抑癌基因的失活，如 Let-7、miR-15、miR-16、miR-34a/b/c、miR-124、miR-143、miR-145、miR-122a等在多種腫瘤中相繼被證實發揮類似抑癌基因的作用［17-22］，而 miR-21、miR-10b、miR-221 和 miR-222 等在多種腫瘤中扮演著類似癌基因的角色［23-26］。

1.5 miRNA的靶基因預測 由于miRNA的功能與其所調控的靶基因密切相關，所以研究miRNA的功能必將涉及對miRNA靶基因的鑒定。但是，miRNA對靶基因的調節通常并不是一一對應的，大多數情況下，一個miRNA同時對多個靶基因發揮調控作用，而一個基因也同時被多個miRNA所調控;況且生物體具有非常復雜的內在機制，miRNA的表達調控并不是孤立存在的，miRNA對基因的調節存在著多種調控機制和作用模式，所以，鑒定miRNA靶基因既是這一研究領域的重點，也是該研究領域的難點。生物信息學的飛速發展使科學家們能夠使用特殊的軟件和數據庫來預測miRNA的靶基因［27］。生物信息學方法主要是基于miRNA和靶基因間的相互作用具有一定的規律性，通過建立計算模型，整合已有的生物學數據，應用某種算法或程序來預測miRNA的靶基因。目前常規的算法和程序一般遵循以下幾條規律:①miRNA靶位點在不同物種之間具有保守性;②miRNA與靶基因之間具有互補性;③miRNA與信使RNA相互之間具有熱穩定性;④miRNA5'端的結合能力比3'端的結合能力強［28］。除了以上這些基本規則外，不同的算法和程序還會根據各自總結的規律進行改進和優化。生物信息學預測方法的應用前景廣闊，使尋找miRNA靶基因有律可循，但是這種方法得出的結果假陽性率很高;并且運用生物信息學預測的miRNA與信使RNA相互作用只是一種理論上的結合，在不同條件下，miRNA究竟以何種作用形式以及水平存在并不能通過生物信息學預測。常用的miRNA靶基因預測網站主要包括，①TargetScan:科學家在2003年開發的一款用于預測哺乳動物miRNA靶基因的軟件，它主要是基于miRNA與信使RNA的堿基互補配對原則，利用miRNA結構序列上的保守性和信使RNA與miRNA相互之間的熱力學穩定性，來預測miRNA靶目標，它為人們提供網絡實時服務，是目前使用頻率最高的miRNA靶基因預測軟件;②miRbase:該軟件可以通過名稱、關鍵詞或序列等方式進行檢索，并可通過鏈接查詢有關該miRNA的主要文獻，對miRNA進行基因組背景分析及靶標預測等;③miRanda:是第一個利用生物信息學對miRNA靶基因進行預測的軟件，于2003年開發設計，應用范圍廣，但假陽性率較高;④PicTar:是研究人員通過特定的計算法則來預測脊椎動物、線蟲、果蠅和人類的非保守但共表達的miRNA的靶基因，并通過實驗方法進行驗證。

1.6 miRNA的靶基因驗證 雖然運用生物信息學的方法可以為研究人員提供大量的信息，且相對簡單、快速，但是，它只是通過理論上的某種計算為研究人員提供某些參考信息，存在一定的局限性和可靠性，還需要通過生物實驗方法進行驗證。最直接的驗證方法是，運用熒光定量聚合酶鏈反應及蛋白質印跡法檢測轉染miRNA后的細胞(組織)中信使RNA水平及蛋白水平，從而明確miRNA與靶基因的對應關系。近年來發展快速的熒光素酶報告基因法由于其快速、靈敏度高以及檢測范圍廣，可以直接驗證miRNA的靶位點。

1.7 miRNA的檢測 目前已有多種方法檢測miRNA，包括基因克隆、Northern blotting、原位雜交、反轉錄聚合酶鏈反應、微陣列芯片及高通量測序等技術。目前，大多數miRNA是通過反轉錄克隆識別和鑒定出來的，這是人們發現miRNA的一個重要方法;Northern blotting是最為經典的檢測RNA的手段，也是目前檢測miRNA表達水平的最主要方法，所有通過克隆和生物信息學分析得來的miRNA都應該經過Northern blotting來驗證和鑒定;原位雜交是了解miRNA時間和組織特異性表達最常用的方法;反轉錄聚合酶鏈反應是一種可以定量分析miRNA表達水平的方式，也可用于驗證生物學預測的miRNA;芯片技術的應用實現了在全基因組水平鑒定成熟miRNA的表達，分析同一細胞中不同的miRNA的差異性表達以及比較不同組織或細胞中miRNAs表達譜的差異，成為高通量檢測的最佳選擇;高通量測序能夠在實驗中發現新的小分子RNA，成功地檢測到了基因芯片未發現的miRNA［29］。

2 miRNA的應用

由于miRNA在生命活動中表現出來的廣泛調節功能以及對基因表達、生長發育和疾病發生、發展等的復雜效應，miRNA自被發現以來即成為生命科學的研究熱點。生命科學研究已經進入后基因組時代，利用miRNA從分子水平來闡明生物體的生命活動過程，闡述物種的起源和生物的演化，來揭示生命的奧秘。基因表達具有時間和空間的特異性，不同物種、組織、細胞，在不同生理、病理狀態下miRNA的表達情況不同，它們可能會成為用于診斷和(或)區分健康與疾病狀態的潛在生物標志物［30］。目前，miRNA已經作為多種疾病的生物標志物［31-33］。此外，理論上，通過改變miRNA的空間結構，可以發現潛在的藥物作用靶點;抑或采用miRNA模擬物、miRNA激動劑、miRNA抑制物以增加或降低病變組織或細胞的miRNA水平，從而下調或上調特異性靶蛋白的表達，開展基于miRNA的分子靶向治療及個體化治療方案［34］。

3 小結

在過去的研究中，人們已經了解了很多關于miRNA的特性及功能的知識，但對miRNA具有的所有特性和功能還缺乏全面的研究;而miRNA在生物體整體分子網絡中扮演的角色的研究才剛剛開始。在未來的研究中，人們將會運用系統生物學方法來研究miRNA參與控制生物體的生長發育以及生物體在不同狀態下的表達水平，對生物體的生命機制進行全面而系統地分析。相信隨著研究的不斷深入，這些研究成果必將會造福于人類。

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