Bcl-2、Bax在青光眼神經節細胞凋亡中的研究進展

王雪維(綜述)，李　燕(審校)

(昆明醫科大學第一附屬醫院眼科，昆明 650031)

Bcl-2、Bax在青光眼神經節細胞凋亡中的研究進展

王雪維△(綜述)，李燕※(審校)

(昆明醫科大學第一附屬醫院眼科，昆明 650031)

摘要：青光眼為人類三大致盲性眼病之一，視網膜神經節細胞凋亡在視神經損傷過程中扮演著重要角色，神經節細胞的凋亡途徑及信號通路尚不完全清楚。Bcl-2家族是細胞凋亡調控的影響因子之一，參與青光眼視網膜神經節細胞的凋亡過程，Bcl-2/Bax的比例決定了神經節細胞是否走向死亡。該文就Bcl-2家族在青光眼神經節細胞凋亡過程中的作用機制及研究進展予以綜述。

關鍵詞：青光眼；Bcl-2/Bax；神經節細胞；細胞凋亡

青光眼是一組以視神經萎縮和視野缺損為特征的疾病，病理改變主要表現為視網膜神經節細胞的減少及神經軸突的丟失。以往研究認為，青光眼視神經損傷主要是由于眼內壓升高，使軸漿阻滯于篩板區，軸突蛋白的生成和轉運減少，神經節細胞丟失[1]。但近年研究發現，在正常眼壓型青光眼、青光眼術后眼壓控制良好的患者，即使眼壓不高于正常，視野丟失也沒有完全停止[2]。針對青光眼神經節細胞丟失機制的討論還在繼續，通過深入了解青光眼視神經損傷的機制，將為臨床青光眼視神經保護藥物的應用提供依據。細胞凋亡受多種相關基因及其蛋白調控，Bc1-2家族的表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一[3]。現就Bcl-2/Bax與青光眼神經節細胞凋亡的機制及國內外研究進展綜述如下。

1Bcl-2、Bax家族的結構及生物學功能

1.1Bcl-2結構及生物學功能抗凋亡蛋白 Bcl-2由239個氨基酸組成，相對分子質量為25 000～26 000，位于線粒體膜、內質網和核膜等處。Bcl-2基因位于 18q21，含有3個外顯子和2個內含子，可編碼26 000的Bcl-2α和22 000的Bcl-2β兩種蛋白，其中Bcl-2α是抑制凋亡作用發揮的主要蛋白，也是線粒體膜的整合蛋白[4]。拓撲學結構顯示，Bc1-2蛋白由7個 α螺旋緊密相連，2個疏水性長α螺旋組成發夾結構，其他5個α螺旋包圍在其四周，中心α螺旋(α5和α6)垂直方向插入脂質雙層膜參與離子通道形成，通過離子通道調節鈣離子及蛋白質分子的流通量，這個三維結構是Bc1-2發揮抗凋亡作用的關鍵結構。研究發現，Bcl-2還可通過蛋白與蛋白之間的復雜熱力作用進行調節[5]。

Bcl-2主要通過以下途徑發揮抑制凋亡作用：①內質網上Bcl-2通過特殊的拓撲結構，控制離子通道開放，降低細胞質內Ca2+水平，實驗證實通過轉基因Bcl-2高表達可使Ca2+依賴性核酸內切酶活性降低，抑制Ca2+從內質網向胞質中的跨膜流動[6]。②Bcl-2可維持氧化還原狀態及提高細胞的谷胱甘肽水平，線粒體上Bcl-2α蛋白為線粒體膜的整合蛋白，通過對抗線粒體巰基的氧化還原狀態以控制其膜電位從而抑制細胞凋亡的發生[7]。Voehringer和Meyn[8]通過Bcl-2基因敲除的小鼠出現與暴露于慢性氧化應激中的小鼠一致的表現，認為Bcl-2在凋亡的起始階段發揮了抗氧化作用。③Bcl-2蛋白通過阻止Bax/Bak的寡聚化，控制線粒體外膜通透轉運孔孔道復合體的開放，抑制線粒體細胞色素 C和凋亡誘導因子等促凋亡因子的釋放，抑制凋亡連鎖反應。④Bcl-2通過與細胞凋亡蛋白(cell death abnormal，CED)9直接作用，可以抑制CED-3/CED-4復合體中CED-4的寡聚作用，從而阻止胱天蛋白酶2(caspase-2)活化，抑制線粒體細胞色素C的釋放，從而起到抗凋亡作用[9-10]。

1.2Bax結構及生物學功能人類的Bax基因位于染色體19q13.3～13.4，由6個外顯子和5個內含子組成，編碼的Bax蛋白由192個氨基酸組成，相對分子質量約為21 000，由9個α螺旋組成，具有BHI、BH2和BH3三個結構域及C末端的跨膜結構域，在C-末端α9螺旋可介導異源二聚體的形成，通過疏水槽與Bcl-2蛋白結合，α螺旋結構是控制線粒體定位和二聚體形成的重要結構[11]。Bax蛋白是構成人B細胞和鼠淋巴干細胞的主要共沉淀蛋白，與 Bcl-2具有21%的同源性。Bax蛋白主要存在于細胞質內，細胞膜、細胞核也有表達，是一種跨膜蛋白。

Bax促凋亡的途徑主要為以下兩種：①通過特殊的BH3結構域識別線粒體膜上的Bcl-2蛋白，結合形成Bax-Bcl- 2異二聚體，抑制Bcl-2的抗凋亡作用；②細胞質內游離的Bax蛋白可直接在線粒體膜上形成Bax-Bax同源二聚體，改變線粒體膜的滲透性，激活caspase反應鏈，釋放細胞色素C釋放至胞質，啟動細胞凋亡過程，引發細胞凋亡連鎖反應。綜上所述，Bax主要是通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，Bcl-2/Bax的比例決定了細胞的命運。

2青光眼視神經損傷與視網膜神經節細胞凋亡

胚胎期視網膜是由神經外胚葉發育而來，從外向內分為10層。其中神經節細胞層約含120萬個節細胞，神經節細胞由較大的胞體及多極突觸組成，是視覺器官的三級神經元，軸突進入神經纖維層，由視乳頭穿行出眼球，被神經膠質細胞分割成神經纖維束，在鞏膜水平通過10層連續片穿過篩板，神經纖維通過篩孔與外側膝狀體核的神經元形成突觸聯系，將視覺信息傳入中樞神經系統。

青光眼的病理改變主要表現為神經節細胞及其軸突的變性、萎縮、喪失[12]。其機制尚不完全明確，國外研究表明，高眼壓引起的軸漿運輸阻斷，可引起阻斷處的膜性細胞器，如線粒體、內質網等細胞內容物在篩板處積聚，造成軸突腫脹[13-14]。同時細胞膜通透性增高，使Cl-、Na+、Ca2+、水進入細胞內，水鈉潴留，神經元細胞水腫壞死。細胞壞死破裂后，谷氨酸由細胞內進入細胞間隙，同時Mǘller細胞活化，導致腫瘤壞死因子α的釋放，引起谷氨酸攝取障礙，使過量的Ca2+進入細胞，引起突觸后反應，并通過Ca2+依賴的凋亡信號通路激活鈣敏感酶導致神經節細胞凋亡。破裂的神經節細胞釋放的谷氨酸可引起正常神經節細胞繼發性凋亡[15]。神經節細胞凋亡過程中線粒體是細胞凋亡的主要作用位點，其膜通透性的變化是凋亡早期標志之一。細胞水腫使膜通透性增加，Ca2+內流后線粒體膜電位降低，釋放大量促凋亡因子，包括caspase、細胞色素C和凋亡誘導因子凋亡誘導因子等。細胞色素C啟動凋亡主要是通過與凋亡蛋白水解酶活化因子1結合，使凋亡蛋白水解酶活化因子1之間相互聚合，聚合物與caspase-9前體形成復合體(即凋亡小體)，進而激活caspase效應蛋白。caspase在正常細胞中以非活性的酶原形式存在，只有在特定條件下caspase才可被特定的蛋白水解，引起凋亡程序的啟動。

3Bcl-2/Bax在視網膜神經節細胞凋亡中的作用機制

正常情況下Bcl-2和Bax兩種蛋白的表達量相對穩定，以維持細胞穩態，而當眼壓增高，神經節細胞內Bax蛋白在細胞內超表達，Bax/Bax同源二聚體的數量明顯增多；Bc1-2高表達時，則Bax/Bax二聚體解離，生成更為穩定的Bcl-2/Bax異源二聚體，對抗其誘導凋亡的作用。Levkovitch-Verbin等[16]在不同的青光眼模型中檢測到Bax基因相對上調，Bcl-2蛋白中的Bax-xl顯著降低，因此，在高眼壓狀態下，神經節細胞是否發生凋亡，與Bax/Bcl-2的比例關系密切。

3.1Bcl-2在視網膜神經節細胞凋亡中的作用機制

3.1.1抑制細胞色素C釋放高眼壓引起的軸漿阻滯使細胞缺血、缺氧并大量自由基釋放，刺激細胞色素C從磷脂層釋放，細胞色素C必須穿過Bax蛋白孔隙釋放到細胞質，刺激形成凋亡小體，激活下游的caspase-9，活化的caspase-9進一步激活caspase-3，引起caspases級聯激活反應。Bcl-2可通過與Bax結合，導致Bax構象改變，阻止細胞色素C釋放進入細胞質，研究證實，通過鈣調磷酸酶磷酸化促凋亡因子Bad，使其與Bcl-xl結合，降低Bcl-xl活性，可增加細胞色素C的釋放，啟動細胞凋亡[17-18]。

3.1.2下調細胞內Ca2+水平Huang等[19]和Sappington等[20]證實，眼壓升高將激活鈣蛋白酶，引起Ca2+水平升高，激活Ca2+依賴的凋亡信號通路，鈣調磷酸酶是線粒體依賴性凋亡的關鍵調節因子之一，眼壓升高激活鈣調磷酸酶，引起下游caspase-9的激活，導致神經節細胞的凋亡。實驗發現[18]，通過加入鈣調磷酸酶抑制劑可以明顯抑制caspase-9的激活，從而降低神經節細胞的凋亡。Bcl-2的特殊拓撲結構可控制離子通道開放，降低細胞質內Ca2+水平，同時Bcl-2高表達可使鈣調磷酸酶的活性降低，抑制Ca2+依賴的細胞凋亡。

3.1.3抑制星形膠質細胞活化青光眼模型中發現大量活化的星形膠質細胞，它可通過產生一氧化氮合酶2合成一氧化氮，刺激細胞釋放促炎性因子(如腫瘤壞死因子α)，激活caspase蛋白，啟動凋亡程序[21]。Almeida等[22]認為，Bcl-2可抑制miR-181的表達，從而抑制星形膠質細胞的活化，并促進神經節細胞軸突再生，Bcl-2對星形膠質細胞的抑制作用也在多個實驗中被發現。

3.2Bax在神經節細胞凋亡過程中作用

3.2.1維持電壓依賴性陰離子通道開放Bax可與電壓依賴性陰離子通道作用誘導細胞色素C釋放[23]。研究表明[24]，Bcl-2家族抗凋亡蛋白的BH4結構域對電壓依賴性陰離子通道的開放有抑制作用，而Bax和Bak的作用類似激活劑使電壓依賴性陰離子通道維持在一個開放的狀態，Bax可與電壓依賴性陰離子通道二聚體綁定而加大它的孔徑利于細胞色素C通過，激活caspase啟動凋亡機制，同時Bax可引起線粒體外膜的完整性丟失，細胞器裂變溶解。

3.2.2促進視神經軸突損傷高眼壓模型中發現，神經節細胞內Ca2+水平增高[19]、活性氧類增多，通過氧化應激激活BH3-only蛋白，活化的BH3-only蛋白激活Bax，Bak引起凋亡[25]。Zalewska等[26]研究閉角型青光眼的視神經軸突發現，凋亡Bak和Bax蛋白表達明顯高于抗凋亡Bcl-2和Bcl-xL蛋白，證明Bax在青光眼軸突損傷中發揮了積極作用。

3.3.3對抗Bcl-2抗凋亡蛋白位于神經節細胞線粒體的促凋亡蛋白Bax，暴露出BH3螺旋，與Bcl-2蛋白中BH1和BH2兩個同源結構域形成的疏水凹槽結合，通過靜電和疏水作用形成異源二聚體，二聚體的形成阻止了Bcl-2的生物活性[27]。同時，過多的Bax蛋白形成Bax/Bax同源二聚體，細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡[28]。

4小結

青光眼致盲率極高，其高眼壓引起的內環境改變，最終均可能通過Bcl-2家族途徑引導細胞凋亡。目前對青光眼視神經保護的研究，主要是通過阻止神經節細胞的凋亡，達到延緩視神經損壞的目的。通過研究視網膜神經節細胞的凋亡途徑，了解Bcl-2家族在凋亡過程中的作用機制及信號通路，可有選擇性地改變Bcl-2家族的表達，阻斷線粒體凋亡途徑，阻止青光眼神經節細胞凋亡。這將給無數青光眼患者帶來福音。

參考文獻

[1]Quigley HA,Addicks EM,Green WR,etal.Optic nerve damage in human glaucoma.ii.the site of injury and susceptibility to damage[J].Arch Ophthalmol,1981,99(4):635-649.

[2]Anderson DR.Normal-tension glaucoma(Low-tension glaucoma)[J].Indian J Ophthalmol, 2011,59 Suppl:S97-101.

[3]Harder JM,Ding Q,Fernandes KA,etal.BCL2L1(BCL-X) promotes survival of adult and developing retinal ganglion cells[J].Mol Cell Neurosci, 2012,51(1/2):53-59.

[4]Roset R,Ortet L,Gil-Gomez G.Role of Bcl-2 family members on apoptosis:what we have learned from knock-out mice[J].Front Biosci, 2007,12:4722-4730.

[5]Neuzil J,Wang XF,Dong LF,etal.Molecular mechanism of ′mitocan′-induced apoptosis in cancer cells epitomizes the multiple roles of reactive oxygen species and Bcl-2 family proteins[J].FEBS Lett, 2006,580(22):5125-5129.

[6]Xu C,Xu W,Palmer AE,etal.BI-1 regulates endoplasmic reticulum Ca2+homeostasis downstream of Bcl-2 family proteins[J].J Biol Chem,2008,283(17):11477-11484.

[7]Metrailler-Ruchonnet I,Pagano A,Carnesecchi S,etal.Bcl-2 protects against hyperoxia-induced apoptosis through inhibition of the mitochondria-dependent pathway[J].Free Radic Biol Med,2007,42(7):1062-1074.

[8]Voehringer DW,Meyn RE.Redox aspects of Bcl-2 function[J].Antioxid Redox Signal,2000,2(3):537-550.

[9]Haeberlein SL.Mitochondrial function in apoptotic neuronal cell death[J].Neurochem Res,2004,29(3):521-530.

[10]Pourkarimi E,Greiss S,Gartner A.Evidence that CED-9/Bcl2 and CED-4/Apaf-1 localization is not consistent with the current model for C.elegans apoptosis induction[J].Cell Death Differ,2012,19(3):406-415.

[11]Suzuki M,Youle RJ,Tjandra N.Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization[J].Cell,2000,103(4):645-654.

[12]Levin LA.Retinal ganglion cells and neuroprotection for glaucoma[J].Surv Ophthalmol,2003,48 Suppl 1:S21-24.

[13]Quigley HA.Ganglion cell death in glaucoma: pathology recapitulates ontogeny[J].Aust N Z J Ophthalmol,1995,23(2):85-91.

[14]Agudo-Barriuso M,Villegas-Perez MP,de Imperial JM,etal.Anatomical and functional damage in experimental glaucoma[J].Curr Opin Pharmacol,2013,13(1):5-11.

[15]Mittag T,Schmidt KG.Mechanisms of neuroprotection against glaucoma [J].Ophthalmologe,2004,101(11):1076-1086.

[16]Levkovitch-Verbin H,Makarovsky D,Vander S.Comparison between axonal and retinal ganglion cell gene expression in various optic nerve injuries including glaucoma[J].Mol Vis,2013,19:2526-

2541.

[17]Huang W,Fileta JB,Dobberfuhl A,etal.Calcineurin cleavage is triggered by elevated intraocular pressure, and calcineurin inhibition blocks retinal ganglion cell death in experimental glaucoma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(34):12242-12247.

[18]Malla RR,Gopinath S,Gondi CS,etal.uPAR and cathepsin B downregulation induces apoptosis by targeting calcineurin A to BAD via Bcl-2 in glioma[J].J Neurooncol,2012,107(1):69-80.

[19]Huang W,Fileta J,Rawe I,etal.Calpain activation in experimental glaucoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(6):3049-3054.

[20]Sappington RM,Sidorova T,Long DJ,etal.TRPV1: contribution to retinal ganglion cell apoptosis and increased intracellular Ca2+with exposure to hydrostatic pressure[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(2):717-728.

[21]Bringmann A,Wiedemann P.Muller glial cells in retinal disease[J].Ophthalmologica,2012,227(1):1-19.

[22]Almeida AS,Queiroga CS,Sousa MF,etal.Carbon monoxide modulates apoptosis by reinforcing oxidative metabolism in astrocytes:role of Bcl-2[J].J Biol Chem,2012,287(14):10761-10770.

[23]Shoshan-Barmatz V,Ben-Hail D.VDAC,a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacological target[J].Mitochondrion,2012,12(1):24-34.

[24]Martinou JC,Youle RJ.Mitochondria in apoptosis: Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J].Dev Cell,2011,21(1):92-101.

[25]Clark AF.The cell and molecular biology of glaucoma:biomechanical factors in glaucoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(5):2473-2475.

[26]Zalewska R,Reszec J,Mariak Z,etal.The expression of Bcl-2,Bcl-xl,Bak and Bax proteins in axons of the optic nerve in closed-angle glaucoma [J].Klin Oczna,2004,106(1/2 Suppl):155-

157.

[27]Lalier L,Cartron PF,Juin P,etal.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis,2007,12(5):887-896.

[28]Verma S,Singh A,Mishra A.Complex disruption effect of natural polyphenols on Bcl-2-Bax:molecular dynamics simulation and essential dynamics study[J].J Biomol Struct Dyn,2014,19:1-13.

Research Progress of Bcl-2,Bax in Glaucoma Retinal Ganion Cell ApoptosisWANGXue-wei，LIYan.(DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliateHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650031,China)

Abstract:Glaucoma is one of the three major blinding eye diseases to human,and apoptosis of retinal ganglion cells is known to play a key role in the process of optic nerve damage.However,the pathway of ganglion cell apoptosis and signaling avenue is not entirely clear.Bcl-2 family is one of the regulatory factors for apoptosis of retinal ganion cell involved in the process.The proportion of Bcl-2/Bax determines whether ganglion cells are dying.Here elaborates the mechanism of action and research progress of Bcl-2 family in glaucoma retinal ganion cell apoptosis.

Key words:Glaucoma; Bcl-2/Bax; Ganglion cells; Cell apoptosis

收稿日期：2014-12-22修回日期:2015-04-28編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.017

中圖分類號：R775.2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4077-03