電化學DNA生物傳感器的指示方法及其臨床研究進展

張　澤，萬廣財，王　娜，于洪偉(綜述)，常　東(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院檢驗科，哈爾濱 150001)

電化學DNA生物傳感器的指示方法及其臨床研究進展

張澤△，萬廣財△，王娜△，于洪偉△(綜述)，常東※(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院檢驗科，哈爾濱 150001)

摘要：電化學DNA生物傳感器是很有前景的核酸分析技術，由于它操作簡便快速、信號靈敏，能與DNA生物芯片兼容等優點，受到了廣泛的關注，成為當今生物學、醫學領域的前沿性課題。它利用雜交原理及電化學標志物為雜交檢測信號，既可以用標記法又可以用非標記法進行檢測，不受顏色影響，可對痕量樣品測定，儀器設備易于集成化和自動化且價格低廉，正朝向便攜式商業化方向發展。實現電化學DNA生物傳感器的準確檢測，實驗中所用到的指示方法發揮很大作用。該文著重闡述在DNA傳感器工作中所運用的指示方法以及其在臨床中的研究進展。

關鍵詞：DNA；電化學活性； 雜交

DNA生物傳感器作為一種簡單的檢測特定DNA序列的方法引起了廣泛的關注，通常情況下，通過與互補鏈雜交來檢測特定DNA序列，雜交能引起信號轉換器的變化，因此，捕捉雜交前后的信號變化來判斷DNA雜交反應情況。電化學檢測DNA的方法大多數需要一些標記元素，將雜交信息放大轉化為可測的電化學信號，如氧化活性分子，它能對單鏈和雜交后的雙鏈加以區分，標志物可以吸附于探針上[1]、檢測鏈上或添加到溶液中[2]；還有一些無標記[3]的方法也被廣泛應用，既可以依靠靶DNA的直接電化學特性，又可以依賴DNA雜交之后界面電性能的變化進行檢測。因此，DNA電化學傳感器的雜交指示方法是此類傳感器的關鍵性問題，現主要介紹標記和非標記的DNA電化學檢測方法及臨床研究進展。

1有標記DNA電化學檢測

有標記的方法主要是指通過吸附、化學修飾或生物親和等把一些具有電化學活性或催化活性的無機或生物粒子等固定在DNA片段上，通過檢測修飾粒子本身或其催化底物的信號來指示雜交過程。在電化學DNA生物傳感器中，標記型雜交指示劑通常是典型的氧化還原活性分子，能插入雙鏈DNA分子中，且不會對單鏈DNA造成很大影響；或者這些分子能優先綁定在單鏈或雙鏈DNA上。也有一些已經報道的標記元素，如酶、納米微粒、脂質體等。

1.1電化學活性物質DNA從靈活的單鏈DNA到相對僵硬雙鏈DNA的變化可以用標記的方法檢測，同樣，也可以用非標記的方法檢測。電活性DNA標志物是一類電活性較好的物質，它們通過化學鍵合作用直接或間接地連接在ssDNA鏈末端，制成帶有標記的ssDNA探針。如二茂鐵和亞甲藍是電化學活性物質，是在DNA電化學生物傳感器中常用的指示劑，將二茂鐵標記到探針的末端，由于單鏈DNA相對靈活，可以使二茂鐵更接近電極表面，因此可以被氧化還原。然而，雜交之后，雙鏈DNA立于電極表面，增加了從電極到二茂鐵的電子轉移距離，使信號發生改變，變化的信號量與雜交程度呈現一定比例關系，因此，可以檢測雜交量。與二茂鐵相比，亞甲藍穩定性較好，且在高濃度的氯化物中能更好地發揮作用。Lai等[4]進一步發展了這一實驗方法，把莖環探針固定于金電極表面，莖環結構特點是它部分為自身雜交，使標志物亞甲藍能更為貼近金電極表面，并且發出較好的電化學信號。

1.2酶在檢測雜交反應中，常將具有氧化還原活性的酶標記在DNA探針上，利用酶的催化放大功能來進行間接測定的方法。當DNA探針與靶DNA雜交后，這些酶與其對應的底物發生催化作用，產生的電信號被用于靶DNA的分析。辣根過氧化物酶就是一種作為標志物的電化學指示劑，Zhang等[5]用電化學酶放大夾心法檢測38個堿基的DNA序列，用辣根過氧化物酶標記于探針末端。通常檢測探針會帶有放射性的標記，或產生光學、電化學等標記。

1.3金屬納米顆粒納米技術的出現為各個科學領域提供了新的發展前景。納米微粒具有大比表面積、高活性、極微小性等特點，與傳感器所要求的多功能、微型化相匹配。DNA探針標記有金屬(常用的是金、銀、鉑)納米顆粒，再與目標DNA雜交后，通過特定處理得到相應的電化學信號。以納米金為例，它能迅速、穩定地吸附核酸、蛋白質等生物分子，而且這些生物分子的生物活性幾乎不會發生改變，所以納米金具有優良的生物相容性，可以作為生物分子的載體。金本身是非常優良的導電材料，具有優異的電化學性質，同時又具有較好的電活性，可作為電化學DNA傳感器的雜交指示劑。Authier等[6]將納米金應用到定量檢測人巨細胞病毒，用金納米探針與人巨細胞病毒的單鏈DNA(人巨細胞病毒 DNA)進行雜交反應，采用陽極溶出伏安法測定溶解得到的金離子，間接測定DNA含量。

1.4脂質體脂質體是一種球型的小囊泡，以水為中心，磷脂雙分子層包繞而成[7-8]，脂質體的內部空穴可以用來貯存酶、蛋白、DNA、藥物或其他物質[9]，形成有標記的脂質體，用于DNA的檢測。對于脂質體的研究不斷發展，已經從傳統的小囊泡發展到通過調整脂質組成、大小和囊泡的量獲得有長循環的第二代脂質體，脂質體的薄膜可以被各種生物活性物質修飾，以獲得特效的活性，大部分脂質體膜修飾物有寡聚核苷酸鏈、抗體、蛋白受體、放射性標志物[10-12]等，鑒于脂質體的諸多優點，因此被用于電化學領域，達到擴大電化學信號的目的。目前的研究把脂質體看作是能樹狀放大DNA感應的微粒子構建元件，提供了一個骨架結構。Nejdl等[13]將Zn(Ⅱ)包裹于脂質體內，金納米粒固定于脂質體外側，該研究成功地說明脂質體適用于Zn(Ⅱ)和核酸的傳送，未來可以用于靶定和控制腫瘤的轉運，以及阻止病毒的繁殖。

2非標記DNA電化學檢測

2.1DNA分子自身電化學活性相對于有標記的方法來說，非標記的方法有很多優勢，它無需對DNA進行標記就能簡單、快速地直接檢測雜交反應，對DNA的活性或折疊等產生較小影響。目前，構建簡單、低成本、無需標記的檢測方法是DNA生物傳感器的發展趨勢。非標記的方法基于DNA本身的電活性或依賴于界面電性能的變化，即雜交后ss-DNA變為ds-DNA時引起的電極界面電性能改變。前者主要是指鳥嘌呤的電化學氧化的變化[14]，因為DNA分子本身具有一定的電活性，主要是由DNA堿基所引起，其中鳥嘌呤是最容易發生氧化反應的堿基，可以在大多數電極上產生氧化還原峰，再者由于它的簡便性和多功能性，在非標記的方法中很受歡迎。Pantos等[15]將磺基水楊酸和單鏈DNA通過電聚合作用修飾到玻碳電極上，利用差分脈沖伏安法，非標記成功地同時檢測腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。

2.2電活性小分子以非標記型電活性小分子雜交指示劑作為識別元素，它與雙鏈DNA結合的能力強于單鏈DNA，單鏈DNA與電活性小分子之間為靜電作用，而雙鏈DNA是靜電作用與內部疏水作用相結合，因此可以對兩者進行區分。現在常見的染料雜交指示劑有亞甲藍、燦爛甲酚藍、吖啶酮衍生物等。亞甲藍在標記型雜交指示劑中的應用，同樣，也可以作為非標記型雜交指示劑的識別元素。Liu等[16]合成一種聚噻吩和亞甲藍的混合物作為一種電化學DNA雜交指示劑，完全雜交后，亞甲基藍功能化的聚噻吩使電流增加，相比單獨的亞甲藍指示劑，亞甲基藍功能化的聚噻吩對緩沖液濃度的變化有更好的抵抗作用。亞甲藍較為常用，本科研組也做過相關實驗研究[17]。

2.3金屬配合物金屬配合物作為一種DNA靶向分子應用廣泛[18]。它可以與DNA的堿基或磷酸骨架相結合，并且能嵌入到雙鏈DNA的溝槽內，發生靜電作用。王茂清等[19]將DNA探針固定于鉑納米顆粒的玻碳電極上，以鄰菲咯啉合鈷[Co(phen)3]3+作為雜交指示劑，用方波伏安法進行檢測，雜交后信號變大。

2.4DNA分子小溝結合劑上述所說的電活性小分子和金屬絡合離子在非標方法中以嵌入劑的形式發揮作用，雖然它們無需標記過程，但是它們既可以與單鏈DNA結合，同時又能與雙鏈DNA相結合。再者，它們易從雙鏈DNA分子上脫落，電化學信號的檢測受到影響，靈敏度降低。要使非標記檢測方法更加靈敏可靠，雜交指示劑起到很重要的作用，DNA分子小溝結合劑與嵌入劑相似，但它與DNA分子結合方式和嵌入劑不同，它是與雙鏈DNA的小溝相結合，而不是嵌入雙鏈DNA分子堿基中，因此，選擇性更加良好，這類物質有紡錘菌素、抗腫瘤抗生素CC-1065、博來菌素、二苯并酰亞胺類染料[20]。

2.5電化學阻抗法非標記方法被擴展到用電化學阻抗法檢測[18,21-23]，該方法是檢測從單鏈修飾的電極到雜交之后感應電流阻抗的變化，由于雙鏈負電荷增加，電荷交換的阻力也隨之增加，電化學阻抗法已經證實對于電極表面生物識別和有功能的生物材料特性方面是一種有效且敏感的方法。目前，電化學阻抗法已經用于導電聚合物或金納米顆粒修飾的肽核酸/DNA生物傳感器中[24-25]。

3臨床研究進展

臨床檢驗與其他一些化學檢驗或測量有所不同，首先是樣品高度復雜，因為臨床中的樣本取自于患者本身，同時受到來自外界和自身的多種因素影響；其次，樣本數量巨大，時效要求較高，因此發展和應用微量、簡便、易自動化的方法是臨床檢驗工作者一直尋求的。目前輔助臨床診斷的一些檢測方法需要經過相對較長的時間才能取得結果，然而，運用電化學生物傳感器能在很大程度上縮短臨床檢測時間，提高臨床檢測的時效性。目前已研制出的可以檢測血糖、尿酸、人絨毛膜促性腺激素、細菌毒素等的生物傳感器。

許多遺傳性疾病是由于基因的異常表達或基因序列突變引起的，雖然在過去的幾年里，關于疾病診斷的試驗和技術不斷發展，但是對于基因相關疾病的早期診斷并不理想，電化學DNA傳感器結合DNA雜交原理，能快速、準確地檢測潛在的危險因素，是目前診斷基因相關疾病的熱點。Mohan等[26]用電化學阻抗法以無標記的方法檢測乳腺癌1號基因，雜交前后，阻抗圖譜明顯變化，檢測限達1×10-17mol/L。

DNA生物傳感器還可用于研究抗腫瘤藥物的作用機制。Brett 等[27]用修飾有雙鏈DNA的玻碳電極來研究鹽酸米托蒽醌與DNA相互作用的機制，結果表明，鹽酸米托蒽醌能破壞拓撲異構酶Ⅱ，從而抑制核酸合成，導致細胞死亡。

4展望

近年來，電化學生物傳感器越來越備受關注，尤其是在尋找新的電極修飾材料、新的指示劑、新的檢測方法方面可進一步提高傳感器性能。電化學DNA生物傳感器的指示方法無論是標記的方法還是無標記的方法，都有各自的優缺點，標記的方法雖然靈敏度較高，但是對探針的預處理易對DNA的活性或折疊等產生影響；無標記的方法雖然簡化了實驗過程，但是靈敏度不如標記的方法。因此，要加緊研究兼顧兩者優點的電化學DNA生物傳感器。

雖然電化學生物傳感器的優點突出，但至今商品化程度還不高，其原因是電化學生物傳感器存在一些不足。盡管如此，它的發展前景仍十分樂觀，依托現在生物技術(如聚合酶鏈反應、酶聯免疫吸附試驗、芯片技術等)提升傳感器的適應性和穩定性，制造出便攜、快速、靈敏的生物傳感器。未來生物傳感器的發展方向如下：首先，實現傳感器的小型化，使之便于攜帶，能滿足床前采樣的需求；其次，可以與其他檢測方法相結合，提高靈敏度；最后，實現多樣品多組分自動化檢測，用一種標志物對多種組分進行檢測，提高電極的檢測效率。隨著生物醫學傳感器的不斷發展，它必將成為現代醫療設備的重要組成部分，在醫療衛生事業中發揮巨大作用。

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The Indicating Methods of DNA Electrochemical Sensor and Progress of Clinical ResearchZHANGZe,WANGuang-cai,WANGNa,YUHong-wei,CHANGDong.(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:DNA electrochemical biosensor is a very promising nucleic acid analysis technology,which is a novel and developing technique combining biochemical,electrochemical,medical and electronic techniques with the advantages of being simple,reliable, cheap,sensitive,selective for genetic detection and convenience for integration and microminiaturization,and has been a hot topic in the field of biochemistry and medicine.DNA electrochemical biosensor are commonly employed to detect specific sequences of DNA.The transduction strategies can be subdivided into two main categories,labeled and label-free approaches.At present,it is developing toward the direction of portable commercial devices.Here is to make a review of the the indicating methods of DNA biosensors and the research development in the clinical application.

Key words:DNA; Electrochemical activity; Hybridization

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-03-30編輯：伊姍

基金項目：國家自然科學基金(81273129)；黑龍江省自然科學基金(D201174)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.002

中圖分類號：R-331

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4036-03