0.2%二氫卟吩鐵可溶粉劑HPLC測定方法不確定度評估

曹 磊

（國家農藥產品質量監督檢驗中心 （南京），江蘇 南京 210007）

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系的參數。評定不確定度是分析工作最基本也是最重要的指標，是反映檢測全過程的重要標志。不確定度評定作為測試和校準方法及方法驗證的一個重要技術，要求實驗室應建立并實施測定不確定度的評價程序。若檢測結果處于標準限量的臨界值時，必須給出不確定度以滿足對檢測結果進行評判，讓客戶從測量結果了解測定數據的離散程度。

二氫卟吩鐵是從蠶沙中提取的具有調節作物生長的家型天然植物生長調節劑，主要作用為調節作物生長，對抗逆和產量都有較好的增收作用。其作用機理是通過抑制葉綠素酶而緩解葉綠素的降解，提高葉綠素含量，并提高光系統Ⅱ （PSⅡ） 的最大光化學效率 （Fv/Fm），能夠促進根細胞內NO的生成和降低吲哚乙酸氧化酶的活性，促進植物根系生長；明顯提高活性氧清除酶活性，促進抗氧化物脯氨酸含量升高。經室內活性試驗和田間藥效試驗，結果表明0.02%二氫卟吩鐵可溶粉劑對油菜生長有較好的調節活性，能夠增加單株角果數，每角粒數，千粒重等[1]。本文研究了液相法測定二氫卟吩鐵含量過程中不確定度的評定與表示方法，具有借鑒及參考意義。

1 實驗方法

1.1 儀器及試劑 Agilent 1260 高效液相色譜儀；250mm×4.6mm （i.d） 不銹鋼柱，內裝Agilent ZORBAX SB-C18，5μm填充物；電子分析天平 （XS105DU 型，METTLER TOLEDO）；超聲清洗儀 （KQ-300E）；甲醇 （含量99.9%，色譜純）；磷酸 （含量 99.5%，分析純）；家蒸二次蒸餾水 （18.2MΩ·cm，Milli-Q）；二氫卟吩鐵標樣 （純度93.0%，國家農藥質檢中心（沈陽） 提供）；0.02%二氫卟吩鐵可溶粉劑（企業提供）。

1.2 色譜條件 流動相：甲醇+磷酸水溶液（pH2.0）=50 +50 （v/v）；流速：1.0mL/min；柱 溫：25℃；檢 測 波 長：392nm；進 樣 體積：5μL；

圖1 標準品色譜圖

1.3 實驗步驟

1.3.1 標準物質溶液的配制 稱取0.05g二氫卟吩鐵標樣 （精確至0.000 2g），置于50mL容量瓶中，加甲醇后超聲使溶解，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度后搖勻過濾即得；

1.3.2 樣品溶液的配制 稱取6g試樣 （精確至0.000 2g），置于 50mL容量瓶中，加甲醇后超聲使溶解，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度后搖勻過濾即得；

1.3.3 按照連續5 針標樣溶液、連續5 針樣品溶液的順序進樣；

1.3.4 計算 試樣中二氫卟吩鐵的質量分數ω1（%） 按右式計算：

式中：

A2——試樣溶液中，二氫卟吩鐵峰面積的平均值；

A1——標樣溶液中，二氫卟吩鐵峰面積的平均值；

m1——標樣的質量，單位為克 （g）；

m2——試樣的質量，單位為克 （g）；

w——二氫卟吩鐵標樣的質量分數，以%表示。

標準品及樣品的典型色譜圖 （圖1 及圖2）：

圖2 樣品色譜圖

2 檢測方法不確定度評定

2.1 不確定度的來源 以二氫卟吩鐵質量分數計算公式為數學模型，可得出不確定度分量來源包括：標準物質純度、標準物質稱量及配制、樣品稱量及配制、標準物質及樣品測量的重復性。

2.2 標準物質純度引入的不確定度 根據標準物質證書中提供的信息，二氫卟吩鐵純度為93.0%，不確定度為 ±0.2%，屬于B類評定。按正態分布[2]，取置信水準為95%，K=2，則有：U1=0.2/（2 ×93.0）=1.08 ×10-3；

2.3 標準物質稱量引入的不確定度 查稱量所使用的電子天平檢定證書，其最大允許誤差為±0.1mg，屬于 B類評定，按正態分布[1]，取置信水準p=99%，K=3，則標準不確定度為：U2=0.1mg/3=0.033 3mg，標準物質重復稱量2次，稱樣量為0.051 2 g，則其相對不確定度為；

2.4 標準物質溶液配制引入的不確定度

2.4.1 50mL容量瓶引起的體積不確定度 容量允許誤差為 ±0.05mL[3]，B類不確定度評定：；

2.4.2 溶液溫度與校準時溫度不同引起的體積不確定度 假設溶液與校準溫度的差異為±5℃，容量瓶體積為50mL，甲醇的體積膨脹系數為1.2 ×10-3/℃，玻璃的膨脹系數為 2.5 ×按矩形分布，取則由校準和使用溫度不同引起的容量瓶體積不確定度為：

2.5 樣品稱量引入的不確定度 參考2.3 所述，樣品重復稱量2 次，稱樣量為6.584 5g，則其相對不確定度為10-6；

2.6 樣品溶液配制引入的不確定度 參考2.4所述，樣品溶液配制引入的相對不確定度即3.44 ×10-3；

2.7 標準物質及樣品測量峰面積的重復性引入的不確定度 標準物質溶液及樣品溶液均重復進樣5 次，峰面積 （表1）：

表1 峰面積測量結果

標準物質峰面積測量重復性引入的相對不確定度為

樣品峰面積測量重復性引入的相對不確定度為

3 合成相對不確定度的評定

綜合上述各不確定分量，得出合成相對不確定度

本次實驗測得0.02%二氫卟吩鐵可溶粉劑中二氫卟吩鐵含量為0.021%，則

4 擴展不確定度的評定

按95%置信概率，取包含因子K=2，則擴展不確定度

故本次采用高效液相色譜法測定0.02%二氫卟吩鐵可溶粉劑中二氫卟吩鐵含量為 （0.021±0.000 2）%。

5 結論

5.1 在不確定度的評估過程中，標準物質含量和標樣及樣品溶液配置、定容操作引入的不確定度占主導地位；

5.2 本試驗最終擴展不確定度的評定結果在符合上述方法和條件的規范化測量情況下可直接引用；

5.3 若按雙平行樣雙針進樣，按照本文所述依次計算各步驟不確定度分量、合成不確定度及擴展不確定度即可。