微生物修復石油污染土壤的生態毒性指示

沈偉航，朱能武,，尹富華，王華金，黨志,

1. 華南理工大學環境與能源學院，廣東 廣州 510006；2. 工業聚集區污染控制與生態修復教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006

微生物修復石油污染土壤的生態毒性指示

沈偉航1，朱能武1,2*，尹富華1，王華金1，黨志1,2

1. 華南理工大學環境與能源學院，廣東 廣州 510006；2. 工業聚集區污染控制與生態修復教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006

發光菌的相對發光度和植物光合色素含量以及土壤酶活性是土壤石油污染程度和生態毒性強弱的綜合反映。為探究不同生物指示方法對石油污染土壤生態毒性的指示效果以及污染土壤在生物修復過程中毒性的變化規律，采用前期篩選分離的三株對石油烴具有良好降解效果的降解菌構建混合菌體系，開展石油污染土壤模擬微生物修復實驗。文章首先以明亮發光桿菌為指示生物考察不同修復時期土壤生態毒性，并以高等植物毒性試驗以及土壤酶活性試驗結果作為輔助證據從生態學角度揭示修復過程中石油污染土壤生態毒性的變化，并分析了以上3種指示方法的一致性。結果表明，該混合菌能高效降解對石油烴污染物，污染土壤經40 d修復后，石油烴污染物濃度從5 000 mg·kg-1降到1 781 mg·kg-1，去除率達到64%。高等植物生態毒性試驗、土壤酶活性試驗與發光菌生態毒性試驗結果呈現良好的一致性，石油污染土壤的生態毒性隨著微生物修復過程的進行呈先上升后下降的趨勢。具體而言，修復初期的土樣對小麥光合色素含量的抑制作用最大，葉綠素a含量相對于對照組降低了39.3%，僅為(1.36±0.04) mg·g-1；土壤過氧化氫酶酶活性與石油烴殘留量呈極顯著負相關關系（-0.973）；污染土壤生態毒性在修復的第8天達到最大，其二氯甲烷/二甲基亞砜浸提液中發光菌的相對發光度為18.1%，與0.187 mg·L-1HgCl2的毒性相當。明亮發光桿菌的相對發光度和小麥光合色素含量以及土壤過氧化氫酶活性能較好地指示石油污染土壤在生物修復過程中的生態毒性，可作為石油污染土壤微生物修復效果的指示生物。

石油污染土壤；生物修復；發光菌；生物指示

石油工業的迅猛發展使得石油污染物對土壤的污染狀況日趨嚴重。石油污染物（烷烴類、芳香烴類以及苯類等）毒性大且具有致癌作用，進入土壤后難以去除，并會引發土壤性質變化甚至地下水污染等重大生態危機，如何有效地修復石油污染土壤已成為全球性的環境難題（黃廷林等，2009）。在眾多修復方法中，石油污染土壤的微生物修復以其對土壤環境干擾小、成本低廉、無二次污染等優點，正逐步成為國內外學者的一個研究熱點（王華金等，2013）。然而，要成功運作石油污染土壤微生物修復仍面臨諸多難題。研究表明，恢復污染土壤的原有生態功能是一個緩慢且復雜的過程（宋玉芳等，2004）。隨著微生物修復過程的進行，污染土壤逐步向健康狀態轉變，并伴隨著土壤及微生物一系列生理生化指標的變化。對石油污染土壤的微生物修復過程及此過程中土壤健康狀況的監測、指示以及生態毒理學研究有助于全面掌握石油污染土壤微生物修復過程中生態毒性的強弱及變化規律。

已有研究表明，土壤生態系統中的敏感指示物能夠較為全面地反映土壤生態毒性（劉五星等，2007）。針對石油污染土壤生態毒性的指示和評價系統，國內外學者提出了包括發光菌毒性試驗、高等植物毒性試驗和土壤酶活性試驗在內的多種生態毒性試驗方法。在這些生態毒性指示方法中，發光細菌生態毒性試驗以其相關性好，靈敏性高、監測效率高等優點而被國內外學者廣泛應用于石油污染土壤修復過程中土壤生態毒性的評價與監測（林志芬等，2001）。有學者采用發光細菌生態毒性性試驗來評價生物堆肥 16個月之后的石油污染土壤的生態毒性，土壤毒性的最大值出現在堆肥的初期，隨著堆肥過程的進行，土壤生態毒性呈減弱趨勢，但仍有較高的生態毒性（Chaineau et al.，2003）。有研究通過發光細菌生態毒性試驗研究兩種不同堆肥條件下的石油污染土壤發現，自然條件下堆肥處理的生態毒性最高可達到人工強化堆肥的4倍（P?aza et al.，2005）。高等植物作為土壤生態系統中的基本組成部分，利用其生長發育狀況及葉片生理生化指標來指示土壤生態毒性是土壤污染生態毒理學診斷的重要組成部分。Banks et al.（2005）以萵苣、粟、蘿卜、紅三葉草和小麥的種子發芽率為指標，考察它們作為供試植物的可行性，結果表明，僅萵苣種子能準確地指示受污土壤和凈土之間生態毒性的差異。土壤酶活性作為土壤微生物新陳代謝是否正常的關鍵性指標，是土壤整體健康狀況的綜合反映（張曉陽，2013），將土壤酶活性作為土壤生態毒性的指示物，也具有理論上的可行性。研究表明，在柴油污染土壤的生物修復過程中土壤脂肪酶和脫氫酶與石油烴殘留量呈顯著負相關，而β葡萄糖苷活性與土壤中石油烴殘留量呈顯著正相關（Riffaldi et al.，2006）。

雖然上述方法在生態毒性指示方面各有優勢，但是涉及不同指示方法的指示效果研究以及它們之間的一致性分析還比較少。由于通過不同指示生物對土壤生態毒性進行指示和評價能夠有效地整合土壤中不同食物鏈生物對有毒有害物質的整體毒性效應，可以較為全面地反映土壤的受污情況。因此，石油污染土壤微生物修復過程需要整合各種生態毒性指示和評價方法對土壤生態系統的安全性做出全面、科學地判斷。課題組前期研究表明，土壤過氧化氫酶活性與土壤中的殘留石油烴相關系數最大（王華金等，2013）；小麥與蘿卜相對于萵苣、黑麥草以及小青菜更適合作為供試植物來指示石油污染土壤的生態毒性變化（沈偉航等，2015）。然而前期研究并未涉及石油污染土壤的復合指示效果研究以及不同指示方法之間的一致性分析。基于此，本研究選取明亮發光桿菌，土壤過氧化氫酶活性以及小麥和蘿卜的葉片光合色素毒性試驗來進一步探究石油污染土壤生態毒性變化規律以及不同方法之間的一致性分析。文章首先通過發光菌毒性試驗考查石油污染土壤微生物修復過程中土壤的生態毒性強弱及變化規律，通過度量發光細菌在不同修復時期土壤中的相對發光強度，并結合毒性等級劃分標準確定石油污染土壤發光菌指示的可行性與敏感性。隨后，文章以高等植物毒性試驗及土壤酶活性試驗結果作為輔助證據從生態學角度揭示石油污染土壤微生物修復過程中殘留的石油污染物和中間代謝產物對土壤生態系統的影響，在佐證發光菌毒性試驗結果的同時也完成了石油污染土壤微生物修復過程中污染土壤的生態毒性變化規律的探究及指示效果的一致性分析。

1 材料與方法

1.1 混合菌的制備

本研究選取課題組前期分離出的洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderiacepacia）中的烷烴降解菌GS3C（CCTCC No. M 207169）；鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）中的菲降解菌GY2B（CCTCC No. M 206019）；伯克菌科 Pandoraea菌屬的pnomenusa種中的芘降解菌 GP3B（CCTCC No. M207167）為初始菌種資源。將上述3種菌株分別取1環進行富集培養，然后在25 mg·mL-1的原油無機鹽培養基（5.0 mL PBS， 1.0 mL CaCl2溶液，1.0 mL FeCl3溶液，3.0 mL MgSO4溶液，1.0 mL微量元素，1000 mL蒸餾水）中分別加入1 mL富集液，接著將投加了石油降解菌的原油無機鹽培養基置于的搖床中馴化培養（30 ℃，150 r·min-1），每 5天為一個馴化周期，共馴化55 d后離心分離分別獲取3種馴化產物。最后將馴化后的GS3C、GY2B、GP3B菌（4.0×108CFU·mL-1）按等量配比的原則（1∶1∶1，V/V/V）復配后形成石油烴降解混合菌。

1.2 石油污染土壤的制備

供試土壤采自廣東增城的水稻田表層土壤。土壤取回經干燥處理后過4.75 mm篩，去除大顆粒物質后分為兩份，一份保存在4 ℃冰箱中并于避光條件下測定新鮮土樣的初始指標（表1），另一份置于陰涼處風干后過2 mm篩，保存待用。實驗用油由廣州石化提供的原油（飽和烴：45.55%，芳烴：17.69%，膠質和瀝青質：9.68%）。

表1 供試土壤的理化性質Table 1 Basic physiochemical properties of the tested soils

在φ15 cm×20 cm塑料盆裝入3 kg干土，將溶于石油醚中的石油均勻地加入土壤中，使土壤中石油烴的初始濃度為5000 mg·kg-1（每千克干土中含5 g原油），并攪拌均勻（Vouillamoz et al.，2001）。接著按3%（每100 g土加3 mL石油烴降解混合菌菌液）的比例接種到石油污染土壤中。

最后將各培養皿置于恒溫培養箱（30 ℃）中進行石油污染土壤的微生物修復實驗，每2天翻土攪拌一次并維持土壤含水率的穩定。實驗過程中，采集微生物修復第0、8、16、24、32、40 d的土壤，分別標記為 S1，S2，S3，S4，S5，S6，同時采集凈土標記為S0，將這7個土樣作為不同微生物修復時期的石油污染土壤，備用（Tang et al.，2010）。

1.3 測試項目及方法

1.3.1 供試原油的標準曲線

原油標準溶液的配制：準確稱取 0.1000 g原油，加入少量正己烷，將其溶解后轉移至50 mL容量瓶中定容，然后搖勻，配制成2 mg·mL-1的標準溶液。系列濃度原油標準溶液的配制：分別移取上述原油標準溶液1、3、5、7、9 mL于25 mL容量瓶中，并用正己烷定容。再分別取1 mL的系列原油溶液定容于25 mL容量瓶中，配成標準系列的濃度分別是3.2、9.6、16、22.4、28.8 mg·L-1。在繪制標準曲線前，先取少量原油標準液于紫外-分光光度計的220～260 nm處進行光譜掃描，找出本研究中油樣的最大吸收波長。然后在最大吸收波長下分別測定標準濃度油樣的吸光度，并將數據進行線性回歸分析，繪制標準曲線。

石油及其產品在紫外區有特征吸收，帶有苯環的芳香族化合物的主要吸收波長為250～260 nm，帶有共軛雙鍵的化合物主要吸收波長為215～230 nm，一般原油的兩個主要吸收波長為225及254 nm（何麗媛，2010）。本研究中的原油樣品在220～260 nm的特征吸收波段下的掃描結果如圖1（a）所示。可以看出，原油樣品在波長225 nm和235 nm處均出現了較強的吸收峰，其中在波長225 nm處為最大吸收峰。研究認為，在最大吸收峰處吸收最大、干擾最小（李寶明，2007）。故本研究中選取225 nm作為最佳吸收波長。在最大吸收峰波長225 nm下，分別測定標準油樣品溶液的吸光度。為了能夠更準確的反映樣品濃度和吸光度之間的關系，對實驗數據進行回歸分析，得到標準曲線，如圖1（b）所示。

圖1 原油標準曲線的繪制Fig. 1 The drafting of crude oil standard curves

標準曲線的線性回歸方程為：

式中：y—吸光值；x—原油濃度，mg·mL-1。

1.3.2 土樣中總石油烴含量的測定

稱取風干土壤5 g于50 mL離心管中，加入適量Na2SO4和10 mL正己烷，然后在1800 r·min-1條件下振蕩1 min，再將其超聲半小時并離心（3000 r·min-1，10 min）收集上清液。重復上述操作4次，確保土樣中的石油烴全部被提取出來。將上述上清液過 0.45 μm 的有機系濾膜后移至旋轉蒸發儀（RE-52CS）中進行濃縮，用25 mL的容量瓶定容，最后在225 nm波長處測定其吸光度值，對照石油的標準曲線，計算出石油污染土樣中石油烴殘留量和降解率（Han et al.，2009）。

式中：α1為土樣中石油烴的初始含量；α2為不同微生物修復時期土樣中石油烴的殘留量。

1.3.3 發光細菌的生態毒性測定

將等質量的污染土壤與無菌蒸餾水混合，在25 ℃條件下，在振蕩機（HZQ-F160）上反復振蕩（120 r·min-1）1 h，隨后土壤水樣于4000 r·min-1的條件下離心30 min，過濾備用。污染土壤二氯甲烷（DCM）/二甲基亞砜（DMSO）浸提液制備：稱取5.0 g土壤，用二氯甲烷（DCM）超聲提取30 min，然后在4000 r·min-1的條件下離心10 min，收集上層液體。重復上述操作4次，確保土壤中的石油烴全部被洗出。然后將萃取液減壓旋轉濃縮至5 mL，再加入5 mL二甲基亞砜（DMSO），然后將該混合物繼續濃縮至5 mL，備用（劉五星等，2007）。

發光菌生態毒性測試在2 mL的測試管中進行，分別向測試管中加入200 μL 22%的NaCl溶液，200 μL的待測溶液，1580 μL的去離子水，20 μL的復蘇好的菌液。加完復蘇好的菌液（實驗所采用的明亮發光桿菌，T3變種凍干粉購于中國科學院南京土壤研究所）后蓋上瓶塞，用手顛倒5次，拔取瓶塞，放回測試架上（Bundy et al.，2004）。反應15 min后在生態毒性測試儀上測定其發光強度（mV）。本研究采用相對發光度（%）（樣品的發光強度除以對照的發光強度），同時根據參比毒物氯化汞的標準曲線，計算出與樣品急性毒性相當的氯化汞濃度（mg·L-1）。

圖2 不同修復時期的土壤中石油烴殘留量及表觀降解率Fig. 2 Changes in TPH removal efficiency and residual oil during different phases of bioremediation

1.3.4 光合色素含量的測定

取不同微生物修復時期的石油污染土樣各 100 g于不同培養皿中，再將小麥（Triticum aestivnm L.）和蘿卜（Raphanus sativus L.）種子（各20粒，購于廣東省農業科學院），均勻嵌入不同培養皿的土樣中，再在種子上面均勻覆蓋20 g對應修復時期的供試土壤，并調節土壤含水率（Al-Mutairi et al.，2008），隨后蓋好玻璃培養皿并置于25 ℃光照培養箱（SPX-250）中培養。黑暗培養2 d后進行為期3 d的光照和黑暗交替培養，每天光照16 h，黑暗培養8 h，維持光照強度為4300 lux（Al-Mutairi，2008；Banks et al.，2005）。種子發芽后在之前的光照條件下繼續培養9 d后，測定不同土壤中小麥和蘿卜的葉片葉綠素a和類胡蘿卜素含量。具體操作為：準確稱取新鮮植物葉片0.1 g（鮮重）用10 mL100%甲醇進行提取，然后放入 4 ℃冰箱中，靜止提取24 h后，提取液在4 ℃、2000 r·min-1下離心15 min，保留上清液。用甲醇做參比溶液，在紫外可見分光光度計下掃描上清液，得到其在400～750 nm波段的吸光度值。

葉綠素a的含量根據Porra的計算公式（3）計算（Porra，2002），類胡蘿卜素的含量，根據公式（4）計算（Parsons et al.，1963）：

式中：A750、A665、A652、A510、A480分別代表波長為750、665、652、510和480 nm下的吸光度值。

1.3.5 過氧化氫酶活性

過氧化氫酶的測定采用高錳酸鉀滴定法測定（周禮愷等，1980）：取5 g過1 mm篩的風干土樣、置于150 mL錐形瓶中，注入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過氧化氫。另設對照（往瓶中注入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過氧化氫，而不加土樣）。將瓶塞緊，置于120 r·min-1往返式搖床上，振蕩30 min。隨后，注入5 mL1.5 mol·L-1硫酸以終止反應，將瓶中內容物用致密濾紙過濾。取25 mL濾液用0.1 mol·L-1高錳酸鉀溶液滴定至微紅色。土壤的過氧化氫酶活性，以單位重量土壤消耗的0.1 mol·L-1高錳酸鉀毫升數（對照與試驗測定的差值）表示，也可以將高錳酸鉀毫升數轉化為氧化氫的毫克數表示。

注：實驗所用試劑均為分析純，購于阿拉丁。

1.4 數據處理

實驗數據使用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性（P=0.05和P=0.01）和相關性統計分析。結果以算術平均值±標準差的形式表示。

2 結果與討論

2.1 石油污染土壤的微生物修復作用

不同微生物修復時期土壤中總石油烴降解率及殘留量如圖2a和2b所示。整體來看，與不投加混合菌的石油污染土壤相比，投加混合菌的污染土壤在石油污染土壤微生物修復的各階段都表現出更高的石油烴降解率以及更低的殘留量。具體而言，在投加菌劑的污染土壤中，從土樣S1到S2石油烴降解率有一個急速的增長過程，之后隨微生物修復過程的進行而穩步上升，在土樣S2～S6中石油烴表觀降解率在54%～64%范圍內變化，從土樣S5開始石油烴的降解率基本維持在64%左右（圖2a），相應地，殘留量也基本保持穩定（1.79 mg·g-1）（圖2b）。在微生物修復的前期，石油污染物的進入為土壤中的微生物提供了豐富的碳源，微生物經過一段時間的適應期之后便開始利用其中易降解的短鏈石油烴進行繁殖，大量消耗了石油中的短鏈石油烴組分，整體呈現出很高的降解率；隨著微生物修復過程的繼續進行，易降解的石油烴組分繼續被大量消耗，殘留物變成了以芳香烴等難降解物為主的混合物，這些物質大多難以被微生物利用，僅有小部分仍在繼續被降解（Margesin et al.，1999），從微生物修復中后期的的數據可以看出在，雖然降解率仍在上升，但上升的速率卻已經十分緩慢，相應地石油烴的殘留量也基本保持穩定。

同時應注意到，在不投加菌劑的污染土壤中，石油烴的降解率隨修復過程的進行也有緩慢上升，但降解速率基本僅維持在16%左右，即使是在土樣S6中仍有83.2%的石油烴被剩余（圖2b），由此可以確認，土壤中土著微生物對石油烴的降解也有貢獻（Langbehn et al.，1995），但其效果遠遠不及本實驗復配形成的混合菌。綜上可知，投加菌劑的污染土壤表觀出的高降解率和低殘留量是復配的降解菌對石油烴污染物的去除起主導作用這一微觀結果的宏觀體現。

2.2 不同修復時期土壤水浸提液及 DCM/DMSO浸提液生態毒性

參比毒物HgCl2的生態毒性分析。將一系列的HgCl2標準液進行生態毒性測試，得到不同濃度對應的發光量，相對于空白對照換算成相對發光度，得到以HgCl2濃度為橫坐標，相對發光度為縱坐標的標準曲線，如圖3（a）所示。

圖3 （a）HgCl2的生態毒性的標準曲線；（b）不同生物修復階段土壤浸提液的生態毒性Fig. 3 (a) The standard curve of ecotoxicityof HgCl2; (b) the ecotoxicity of soil extracts in different phases of bioremediation The asterisk (*) indicates differences at the 0.05 level compared with the control group (S0). The double asterisks (**) indicates differences at the 0.01 level compared with the control group (S0)n.s. not significant

其標準曲線的回歸方程為：

其中：y為相對發光度（%）；x為HgCl2的標準液濃度，mg·L-1。

在國標GB/T15441─1995（水質急性毒性的測定-放光細菌法）中規定：當氯化汞標準液濃度為0.10 mg·L-1，發光細菌的相對發光度為50%，其誤差不能超過±10%，否則更換發光細菌凍干粉，重新進行測定。按照該標準進行本研究中標準曲線的檢驗，將 x=0.10代入上式，得到 y=58.006，其誤差η=8.006%<10%，這說明了 HgCl2系列的標準液生態毒性可以作為本研究的參比毒物的生態毒性。

此外，可以看出不同修復時期土壤的發光細菌相對發光強度呈現“先減弱后增強”的趨勢。當發光細菌受到外界影響時，其發光過程就會受到相應的干擾，并且發光細菌的發光強度與毒性作用強度呈負相關關系（馬梅等，1998）。這說明土壤中的生態毒性強度是先增強后減弱的，這與（Xu et al.，2010）以及（Al-Mutairi et al.，2008）的研究結果是一致的。其中以土樣 S2的生態毒性最大，其次是土樣S3，相對發光度分別為18.1%和18.8%，對照表2中美國Microtox的毒性等級劃分可以看出：它們的生態毒性級別為劇毒，同時對照通過公式（4）計算可知土樣S2的生態毒性值與0.187 mg·L-1的HgCl2毒性相當，土樣S3的生態毒性值與0.185mg·L-1的HgCl2毒性相當。隨著修復的進行土壤的生態毒性有所降低，在修復結束后，土樣 S6的DCM/DMSO浸提液中發光菌的相對發光度為51.4%，其生態毒性級別為中毒，與 0.114 mg·L-1HgCl2的毒性相當。

表2 國外發光細菌的生態毒性實驗毒性等級劃分Table 2 The toxicity classification on Microtox test in different state

微生物修復初始階段，由于高濃度的石油污染物進入土壤中危害到了混合菌的生長代謝，從而導致初始階段土壤浸提液表現出強生態毒性。隨著修復的進行，毒性有所降低但仍高于對照組。值得注意的是，強烈的生態毒性是出現在生物修復的前中期，此時大部分烴類污染物已被去除。這可能是由于微生物在修復石油污染土壤過程中產生了毒性更強的中間體或者代謝產物（Al-Mutairi et al.，2008）。這也可以看出，目標污染物濃度的降低并不意味著其生態毒性的減弱，中間代謝產物的生成或者是污染物的生物可利用性變化可能會產生更強的生態毒性（Xu et al.，2010）。

此外，由于不同的石油烴降解微生物對石油烴的代謝途徑存在差異，在實際修復過程中構建混合菌體系中微生物的種類、復配比例等因素都會對微生物降解石油烴產生較為明顯的影響，從而導致土壤的毒性存在差異（冷凱良等，2001）。石油類污染物進入土壤后會破壞原有的土壤生態系統，引起土壤中生物的分子、細胞、個體、種群和群落五個水平的響應（焦海華等，2013），進而會對土壤生態系統食物鏈上的生物體的遺傳物質進行誘導并產生一系列的變化，影響遺傳物質的傳遞和表達，最終表現出與正常生物個體不同的外部癥狀（楊麗芹等，2011）。在過去的很長一段時間里，學者們普遍將石油烴目標污染物作為評價污染土壤修復效果的一項指標。然而，土壤環境本身就是一個復雜的系統，化學方法并不能科學、全面地評價土壤的修復效果和表征修復后土壤整體的質量特征，需要采用其他方法對此作出補充（趙晴等，2005）。

雖然發光菌毒性試驗結果很好地指示了石油污染土壤的生態毒性，但涉及不同指示方法之間的效果及一致性分析的研究還比較少。由于通過不同指示生物對土壤生態毒性進行指示和評價可以有效地集合土壤中不同食物鏈生物對有毒有害物質的整體毒性效應，能較為全面地反饋土壤的污染信息。因此，本文通過高等植物毒理性試驗以及土壤酶活性試驗進一步佐證發光菌毒性試驗結果的正確性，整合這幾種毒性試驗方法，進行相互檢驗以及一致性分析。借此對土壤系統的生態安全性做出全面、科學地判斷。

2.3 高等植物光合色素試驗

石油污染物對高等植物光合作用的影響是它們受害的重要原因之一，即便生長于不同生態毒性土壤中的植物外在形貌上的差異不大，其生理機能如光合作用強度、光合時間長短以及光合色素含量等均受到不同程度的影響（廖長君，2015；盧麗麗，2008）。其中，光合色素在植物光合作用的光吸收過程中起關鍵作用，且與各種形式的生命活動緊密聯系在一起，發揮著著不可替代的作用。因此，探究石油污染土壤對植物葉片光合色素含量的影響，有助于理解植物在污染土壤中的生長狀況，進而推斷石油污染物的生態毒性強弱。

不同微生物修復時期污染土壤中小麥和蘿卜葉片中的葉綠素a以及胡蘿卜素含量變化如圖4所示。可以看出，小麥的葉綠素a含量在不同微生物修復時期的污染土壤中均表現出顯著抑制作用，其中土樣 S1對其抑制作用達到最大，相對于對照組S0(2.24±0.08) mg·g-1降低了39.3%，僅為(1.36±0.04) mg·g-1；其次是土樣 S3和 S4，分別相對于對照組S0減少了34.6%和37.3%，最終葉綠素a的含量分別為1.46±0.07和(1.39±0.29) mg·g-1。小麥類胡蘿卜素含量和葉綠素a含量的變化趨勢一致，兩者在統計學上具有極顯著的正相關性，r=0.996（P<0.01），這說明在石油污染的脅迫下葉綠素a和類胡蘿卜素含量具有較好的一致性。

圖4 原油對小麥和蘿卜葉片光合色素的影響Fig. 4 Effects of crude oil on the photosynthetic pigments (Triticumacstivnm L.andRaphanussativusL.)

一方面石油污染物進入土壤會降低土壤養分的有效性、干擾植物細胞的正常生理活動，削弱植物對土壤養分的攝取，進而影響植物光合色素的合成（Karthikeyan et al.，2014）；另一方面，在石油土壤中的余油以及微生物修復過程中的中間代謝產物會破壞細胞膜和葉綠體結構的破壞導致植物的光合作用（Xie et al.，2014）。也有研究表明光合色素的降低可能與氣孔的變化密切相關。例如，鉛的重毒性可引起茄子（Solarium melongena）葉綠素含量明顯降低，鉛濃度對氣孔參數具有負作用（Yilmaz et al.，2009）。由于植物所生長的土壤生態毒性越強，植物生理生化過程受到的抑制就越強，有機物質合成受阻，部分酶的功能受到抑制，最終導致光合色素含量降低越明顯（Cartmill et al.，2014；Xie et al.，2014）。所以小麥光合色素含量可以間接地反映石油污染土壤的生態毒性的強弱。以上結果說明石油污染土壤的生態毒性在前中期較強，后期生態毒性有所減弱但仍強于對照組，該結果與發光菌毒性試驗結果吻合。

《義務教育語文課程標準（2011年版）》中指出：“各個學段的閱讀教學都要重視朗讀和默讀。”從某種意義上說，學生朗讀的水平直接體現其語文素養的高低。語文課程的學科特點決定了必須通過大量的朗讀和背誦來積累語言，提高語言文字的運用能力。全國著名特級教師于永正說：“語文教學的亮點，首先應該在朗讀上，老師讀得正確、流利、有感情，并引導學生讀得正確、流利、有感情，是一種美好的境界。師生能讀得入情入境的語文課堂，一定是充滿生機、充滿靈性、充滿情趣的語文課堂。”教學中，教師應做到因文而異，帶領學生讀出文章的抑揚頓挫，讀出作者的喜怒哀樂，展現語文課程的學科魅力。

與此相反，從圖4可以看出，蘿卜的葉綠素a含量在不同修復時期的污染土壤中均表現出誘導作用，其中在修復的前中期（S1、S2、S3、S4）與對照組之間出現顯著誘導，相對于對照處理組S0(0.58±0.00)分別高出了 32.3%、30.0%、11.3%和15.8%，蘿卜的葉綠素 a含量最終分別到達(0.76±0.02)，(0.75±0.02)，(0.64±0.02)和(0.67±0.03) mg·g-1。蘿卜的類胡蘿卜素的結果和葉綠素 a結果同樣表現出極顯著的正相關性。這與小麥的葉綠素a和類胡蘿卜素結果恰好相反，說明不同的植物種類在石油污染脅迫下葉綠素a和類胡蘿卜素的變化表現出差異。大多數植物在污染物的脅迫下會出現光合作用強度減弱、光合色素含量下降的情形。如Pb能抑制菠菜葉綠素中光合電子傳遞，抑制光合作用中對CO2的固定（吳曉，2008）；Cd主要抑制光化學系統中的電子轉運，影響光合磷酸化作用，并增加葉肉細胞對氣體的阻力，從而使光合作用下降。然而，本研究結果表明石油污染物卻對蘿卜葉片的光合色素的含量起誘導作用，這可能與蘿卜對石油污染物的響應機制有關，具體原因需要進一步探索。

2.4 土壤酶活性實驗

石油污染土壤微生物修復過程中生態毒性的變化會直接導致土壤微生物的活性的變化，進而引發土壤酶活性的變化。土壤酶活性作為土壤微生物新陳代謝是否正常的關鍵性指標，是土壤整體健康狀況的綜合反映（張曉陽，2013）。其中，過氧化氫酶形成于微生物體呼吸氧化有機物的過程，廣泛存在于微生物細胞中，是生物防御體系的關鍵酶之一。它能直接將對生物體有毒害作用的 H2O2催化分解為無害的H2O與O2，避免強氧化性·OH的形成，進而解除H2O2對微生物的損害（藺昕等，2005），將其作為土壤生態毒性的指示物，具有理論上的可行性。本文在課題組前期的研究基礎上優選過氧化氫酶作為土壤酶的代表（王華金等，2013），考察了 H2O2酶的活性在接種外源石油降解混合菌劑的石油污染土壤修復過程中的變化情況，并將其與石油烴殘留量進行耦合進行了相關性分析以及線性擬合，用于估計該微生物修復體系中土壤 H2O2酶活性和石油烴殘留量的關系。

不同預處理的土壤在各修復階段的 H2O2酶活性變化如圖5所示。總體來看，不同預處理的土壤中H2O2酶活性高低順序為：投加菌的污染土壤>凈土>未加菌的污染土壤。具體而言，未投加菌劑的污染土壤中 H2O2酶活性始終維持在較低水平（2.39～2.51 mg H2O2·(g干土)-1·h-1），明顯低于無污染的土壤（2.60～2.74 mg H2O2·(g干土)-1·h-1），這說明石油污染物對土壤H2O2酶活性產生了抑制作用。而在投加菌劑的污染土壤中，從S1（2.395）到S2（3.003 mg H2O2·(g干土)-1·h-1），H2O2酶活性有一個快速、明顯的上升過程，該階段 H2O2酶活性的增長速率最大，達到25.3%；隨后修復階段的土樣S3和S4中酶活性的增長速率急劇下降（僅為2.392%和2.984%），并最終在土樣S4中H2O2酶活性在達到最大（3.167mg H2O2·(g干土)-1·h-1）；接下來的土樣 S5，S6中 H2O2酶活性呈緩慢的下降趨勢（-3.258%和-1.222%）。

圖5 不同預處理的土壤在各修復階段的H2O2酶活性Fig. 5 Catalase activity activity of the soil samples in different phases of bioremediation

初始階段，石油烴進入土壤為石油烴降解微生物提供了大量的營養物質，促進了土壤中石油降解微生物的大量繁殖，微生物的呼吸作用增強產生大量 H2O2，微生物分泌 H2O2酶來降低過量的 H2O2對微生物體的毒害作用，這導致了土壤中 H2O2酶活性迅速增強（吳偉林等，2010）。隨著修復的進行，土壤中 C∶N∶P的比例逐漸失衡，且石油烴在生物修復過程中產生了某些具有強烈毒性的中間產物，初步抑制了微生物的活性，導致了 H2O2酶活性的增長速率急劇下降（Al-Mutairi et al.，2008；魯莽等，2009）。從土樣S4開始，隨著C∶N∶P的比例的進一步失衡，微生物生長所需營養物質消耗殆盡，并且石油烴的強毒性中間代謝產物進一步累積使得 H2O2酶活性開始下降，這表明石油污染物已經開始嚴重破壞微生物的正常生理活動。此外，可以預見，雖然 H2O2酶能分解微生物的呼吸過程產生的H2O2，但分解能力的局限會導致剩余H2O2在土壤中積累，對微生物產生毒害作用，加劇H2O2酶活性的降低。

進一步對石油污染土壤微生物修復過程中土樣酶活性與石油殘留量的相關性分析表明，H2O2酶活性與石油殘留量呈極顯著相關性，相關系數為-0.973（P=0.001）；同時以土壤石油烴殘留量為自變量（x），土壤酶活性為因變量（y），進行線性擬合分析可得表3。

表3 H2O2酶活性與土壤殘油的相關性分析及線型回歸方程Table 3 Correlation analysis and linear regression equations between catalase activity and residual oil

H2O2酶活性與土壤殘油的線型回歸方程如下：

從整個微生物修復過程中，綜合3種土壤中過氧化氫酶活性來看，土壤中的土著微生物對解除石油污染土壤的生態毒性作用不大，表現為未投加菌劑的污染土壤中氧化氫酶活性在整個修復過程中始終維持在極低水平且上升幅度極小；投加菌劑的污染土壤中過氧化氫酶活性維持在較高水平且上升幅度大。這也驗證了之前的試驗一致：本試驗中外源添加的復合菌劑對石油污染物的去除起主導作用。同時可以看到，投加菌劑的污染土壤中活性高，只能說明石油烴殘留低，并不意味著生態毒性始終維持在低水平，微生物修復前期產生的強毒性中間代謝產物會初步抑制微生物活性并逐步累積導致微生物的正常代謝活動被破壞。前期表現為隨石油烴殘留量的減少，過氧化氫酶活性上升速率逐漸降低；后期表現為隨石油烴殘留量的減少，過氧化氫酶活性逐漸減弱。該試驗結果也可以間接說明石油污染土壤微生物修復過程中的生態毒性在前期因中間代謝產物的生成而增強，后期部分適應了新的土壤環境的微生物開始降解中間代謝產物導致石油污染土壤生態毒性減弱。

2.5 微生物修復石油污染土壤過程中的生態毒性

目標污染物的濃度是評價石油污染土壤微生物修復效果的重要指標之一，然而土壤生態環境的多樣性以及石油污染物組分的復雜性使得通過化學方法將土壤中所有的有毒物質一一檢測幾乎不可能實現。研究表明，土壤環境本身就是一個復雜的系統，一般的化學方法并不足以科學、全面地評價污染土壤的生態修復效果并指示微生物修復后土壤整體的健康狀況。此外，即便石油污染土壤中目標污染物的含量達到環境質量標準，但殘留的難降解組分以及微生物生成的某些中間產物仍會使土壤具備較強的生態毒性，并且最終會在生物體上體現出來。所以，化學診斷的局限性決定了用單一化學方法監測和診斷土壤的微生物修復效果已不能準確指示石油污染土壤生態毒性的強弱。

本研究以發光細菌的相對發光強度為主要指標對不同修復時期石油污染土壤生態毒性進行了分析診斷，并以高等植物毒性試驗以及土壤酶活性試驗結果作為輔助證據來評價了石油污染土壤微生物的修復效果并分析了這 3種指示方法的一致性。通過對比分析可以看出，高等植物光合色素毒性試驗、土壤過氧化氫酶和發光細菌生態毒性試驗結果之間存在良好的一致性，都表明污染土壤生態毒性隨修復時間的延長呈現先增大后減弱的變化趨勢。具體而言，發光菌生態毒性試驗結果表明，不同修復時期土壤的發光細菌相對發光強度呈現“先減弱后增強”的變化趨勢。當發光細菌受到外界影響時，其發光過程就會受到相應的干擾，并且發光細菌的發光強度與毒性作用強度呈線性負相關關系。這說明了土壤中的生態毒性強度也是先增強后減弱。從高等植物光合色素毒性試驗結果分析可得，植物光合色素的響應并不是隨石油烴的濃度的變化呈現出對應的變化趨勢，最高的石油烴濃度并不會對供試植物的光合色素含量產生最強的抑制作用；在石油污染土壤修復過程的前中期，石油污染土壤對小麥葉片光合色素含量的抑制作用最為明顯。同時，不同植物（小麥與蘿卜）對石油污染土壤的生態毒性響應呈相反趨勢。從土壤過氧化氫酶活性試驗結果分析可得，投加菌劑的污染土壤中較高的過氧化氫酶活性以及較低的石油烴殘留并不意味著石油污染土壤的生態毒性始終維持在低水平，微生物修復前期產生的強毒性中間代謝產物會初步抑制微生物活性并逐步累積導致微生物的正常代謝活動被破壞。隨著石油烴殘留量的減少，前期表現為過氧化氫酶活性上升速率逐漸降低，后期表現為過氧化氫酶活性逐漸減弱。該試驗結果也間接說明了微生物修復土壤的生態毒性在前期因中間代謝產物的生成而增強，后期有減弱趨勢。以上結果說明，在石油污染土壤的微生物修復過程中，石油烴目標污染物殘留量作為一個化學指標，它的減少并不能說明受污土壤的修復效果好，應結合土壤的生態毒理學試驗，綜合評價土壤的修復效果和健康狀況。

在石油污染土壤中，即使石油目標污染物的含量達到環境標準，土壤的生態毒性仍然很強，而且在生物體上會最終表現出來（Al-Mutairi et al.，2008）。有研究表明盡管微生物修復后的石油烴總量僅為原來的35%，但指示生物的生態毒性評價結果顯示生態毒性的最大值出現在修復第一階段，并且受污土壤在整個修復過程中均有一定的生態毒性效應（Hubálek et al.，2007）。石油污染土壤的生態毒性隨著微生物修復過程的進行而變得復雜，生態毒性在微生物修復的前中期表現為增強，可能的主要原因有以下兩點：（a）微生物修復的前期易降解、毒性低的短鏈石油烴含量的減少，難降解物質（如多環芳烴等，毒性明顯高于短鏈石油烴類物質）含量的相對增加；（b）修復過程中微生物的代謝中間產物的產生，導致其毒性要強于原來的污染物。已有研究表明，某些烴尤其是PAHs的氧化中間產物具有比其母本石油烴更強的生態毒性（Al-Mutairi et al.，2008）。因此，在石油污染土壤微生物修復過程中，應對微生物的次生代謝產物以及中間代謝產物予以足夠的重視。在石油污染土壤微生物修復后期，部分微生物開始利用少量的多環芳烴等難降解物質作為碳源來維持自身生命活動，土壤的生態毒性呈下降趨勢；此外，能夠適應土壤新環境的微生物被保留下來，它們可以利用中間代謝產物進行新陳代謝。可以看出，隨著石油污染土微生物壤修復時間的延長，受污土壤的生態風險逐漸降低。理論與實踐均表明，恢復石油污染土壤的原有的生態功能是一個長期而復雜的生態過程。

3 結論

（1）在發光細菌的生態毒性實驗中，土壤的生態毒性呈現先上升后降低的趨勢。土樣 S1的生態毒性最大，其DCM/DMSO浸提液中發光菌的相對發光度為18.1%，與0.187 mg·L-1HgCl2的毒性相當。明亮發光桿菌的相對發光度能夠敏感地指示石油污染土壤的生態毒性。

（2）在植物光合色素毒性試驗中，修復前期的土壤對小麥葉片光合色素含量的抑制最為明顯，后期抑制效果減弱。小麥與蘿卜葉片光合色素含量對石油污染土壤生態毒性的響應存在巨大差異。

（3）土壤過氧化氫酶酶活性與石油烴殘留量呈極顯著負相關關系（-0.973），土壤過氧化氫酶活性試驗與發光菌毒性試驗以及植物光合色素毒性試驗結果呈現良好的一致性。

（4）石油污染土壤微生物修復過程中，目標石油烴污染物殘留量的減少并不意味著土壤生態毒性的降低，石油污染土壤微生物修復過程中土壤生態毒性的變化呈復雜化趨勢。石油污染土壤的生態毒性在修復的前中期達到最大，后期逐漸減弱，且在整個微生物修復過程中均存在一定的生態毒性。

AL-MUTAIRI N, BUFARSAN A, AL-RUKAIBI F. 2008. Ecorisk evaluation and treatability potential of soils contaminated with petroleum hydrocarbon-based fuels [J]. Chemosphere, 74(1): 142-148.

BANKS M K, SCHULTZ K E. 2005. Comparison of plants for germination toxicity tests in petroleum-contaminated soils [J]. Water Air and Soil Pollution, 167(1-4): 211-219.

BUNDY J G, PATON G I, CAMPBELL C D. 2004. Combined microbial community level and single species biosensor responses to monitor recovery of oil polluted soil [J]. Soil Biology and Biochemistry, 36(7): 1149-1159.

CARTMILL A D, CARTMILL D L, ALARCON A. 2014. Controlled release fertilizer increased phytoremediation of petroleum-contaminated sandy soil [J]. International Journal of Phytoremediation, 16(3): 285-301.

CHAINEAU C H, YEPREMIAN C, VIDALIE J F et al. 2003. Bioremediation of a crude oil-polluted soil: Biodegradation, leaching and toxicity assessments [J]. Water Air and Soil Pollution, 144(1): 419-440.

HAN M, JI G, NI J. 2009. Washing of field weathered crude oil contaminated soil with an environmentally compatible surfactant, alkyl polyglucoside [J]. Chemosphere, 76(5): 579-586.

HUBáLEK T, VOSáHLOVá S, MATěJ? V et al. 2007. Ecotoxicity monitoring of hydrocarbon-contaminated soil during bioremediation: a case study [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 52(1): 1-7.

KARTHIKEYAN M, HUSSAIN N, GAJALAKSHMI S et al. 2014. Effect of vermicast generated from an allelopathic weed lantana (Lantana camara) on seed germination, plant growth, and yield of cluster bean (Cyamopsis tetragonoloba) [J]. Environmental Science and Pollution Research, 21(21): 12539-12548.

LANGBEHN A, STEINHART H. 1995. Biodegradation studies of hydrocarbons in soils by analyzing metabolites formed [J]. Chemosphere, 30(5): 855-868.

MARGESIN R, ZIMMERBAUER A, SCHINNER F. 1999. Soil lipase activity-a useful indicator of oil biodegradation [J]. Biotechnology Techniques, 13(12): 859-863.

PARSONS T R, STRICKLAND J D. 1963. Discussion of spectrophotometric determination of marine-plant pigments, with revised equations for ascertaining chlorophylls and carotenoids [J]. Journal of Marine Research, 21(3): 155-163.

P?AZA G, NA??CZ-JAWECKI G, ULFIG K et al. 2005.The application of bioassays as indicators of petroleum-contaminated soil remediation [J]. Chemosphere, 59(2): 289-296.

PORRA R J. 2002. The chequered history of the development and use of simultaneous equations for the accurate determination of chlorophylls a and b [J]. Photosynthesis Research, 73(1-3): 149-156.

RIFFALDI R, LEVI-MINZI R, CARDELLI R et al. 2006. Soil biological activities in monitoring the bioremediation of diesel oil-contaminated soil [J]. Water Air and Soil Pollution, 170(1-4): 3-15.

TANG X, HE L Y, TAO X Q et al. 2010. Construction of an artificial microalgal-bacterial consortium that efficiently degrades crude oil [J]. Journal of Hazardous Materials, 181(1-3): 1158-1162.

VOUILLAMOZ J, MILKE M W. 2001. Effect of compost in phytoremediation of diesel-contaminated soils [J]. Water Science and Technology, 43(2): 291-295.

XIE Y, TAO G, CHEN Q et al. 2014. Effects of Perchlorate Stress on Growth and Physiological Characteristics of Rice (Oryza sativa L.) Seedlings [J]. Water Air and Soil Pollution, 225: (2077-2078).

XU Y, LU M. 2010. Bioremediation of crude oil-contaminated soil: comparison of different biostimulation and bioaugmentation treatments [J]. Journal of Hazardous Materials, 183(1): 395-401.

YILMAZ K, AKINCI I E, AKINCI S. 2009. Effect of lead accumulation on growth and mineral composition of eggplant seedlings (Solanum melongena) [J]. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 37(3): 189-199.

何麗媛. 2010. 高效石油降解菌群的構建及其固定化研究[D]. 廣州: 華南理工大學.

黃廷林, 徐金蘭, 唐智新, 等. 2009. 生物菌劑對石油污染土壤生物修復作用的研究[J]. 環境科學, 30(6): 1838-1843.

焦海華, 劉穎, 金德才, 等. 2013. 牽牛花對石油污染鹽堿土壤微生物群落與石油烴降解的影響[J]. 環境科學學報, (12): 3350-3358.

冷凱良, 楚曉珉, 張輝珍, 等. 2001. 微生物對石油烴降解代謝產物的分析方法研究[J]. 海洋水產研究, 22(2): 57-61.

李寶明. 2007. 石油污染土壤微生物修復的研究[D]. 北京: 中國農業科學院.

廖長君. 2015. 玉米CT38對石油污染土壤的修復研究[D]. 廣州: 華南理工大學.

林志芬, 于紅霞, 許士奮, 等. 2001. 發光菌生物毒性測試方法的改進[J].環境科學, 22(2): 114-117.

藺昕, 李培軍, 孫鐵珩, 等. 2005. 石油污染土壤的生物修復與土壤酶活性關系[J]. 生態學雜志, 24(10): 1226-1229.

劉五星, 駱永明, 滕應, 等. 2007. 石油污染土壤的生態風險評價和生物修復Ⅱ.石油污染土壤的理化性質和微生物生態變化研究[J]. 土壤學報, 44(5): 848-853.

盧麗麗. 2008. 石油污染土壤的植物修復研究[D]. 西安: 西安建筑科技大學.

魯莽, 張忠智, 孫珊珊, 等. 2009. 植物根際強化修復石油污染土壤的研究[J]. 環境科學, 30(12): 3703-3709.

馬梅, 童中華, 王子健, 等. 1998. 新型淡水發光菌(Vibrio qinghaiensis sp.—Q67)應用于環境樣品毒性測試的初步研究[J]. 環境科學學報, 18(1):88-93.

沈偉航, 朱能武, 商儒, 等. 2015. 石油污染土壤微生物修復過程中植物毒 性 變 化 規 律 [J/OL]. 環 境 科 學 學 報 , http://www.cnki.net/kcms/detail/ 11.1843.X.20150617.1502.001.html.

宋玉芳, 宋雪英, 張薇, 等. 2004. 污染土壤生物修復中存在問題的探討[J]. 環境科學, 25(2): 129-133.

王華金, 朱能武, 楊崇, 等. 2013. 石油污染土壤生物修復對土壤酶活性的影響[J]. 農業環境科學學報, 32(6): 1178-1184.

吳偉林, 張秀霞, 單寶來, 等. 2010. 不同處置方式對石油污染土壤理化性質和生物學特性的影響[J]. 石油學報(石油加工), 26(5): 831-834.

吳曉. 2008. 鉛離子對菠菜光合作用的若干抑制機制[D]. 蘇州: 蘇州大學.

楊麗芹, 蔣繼輝. 2011. 微生物對石油烴類的降解機理[J]. 油氣田環境保護, 21(2): 24-26.

張曉陽. 2013. 陜北石油污染對土壤理化性質和酶活性的影響[D]. 楊凌:西北農林科技大學.

趙晴, 張甲耀, 陳蘭洲, 等. 2005. 疏水性石油烴降解菌細胞表面疏水性及降解特性[J]. 環境科學, 26(5):132-136.

周禮愷, 張志明. 1980. 土壤酶活性的測定方法[J]. 土壤通報, (5):37-38.

Study on Combined Bioindicators in Ecotoxicity Monitoring of Oil-contaminated Soil during Bioremediation

SHEN Weihang1, ZHU Nengwu1,2*, YIN Fuhua1, WANG Huajin1, DANG Zhi1,2
1. School of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China 2. Key Laboratory of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, Ministry of Education, Guangzhou 510006, China

Bacterial luminescence, content of photosynthetic pigments together with soil enzyme activity could be used to comprehensively reflecting the soil health condition. In order to explore the soil ecotoxicity patterns and biological indicator effects, bioremediation of oil-contaminated soil were conducted. Oil degrading bacterial consortium were built with three strains isolated from oil-contaminated soil. Bacterial luminescence, chlorophyll a and carotene contents, and soil catalase activity was employed to evaluate the ecotoxicity of soil sampled in different bioremediation phases. Good consistency can be obtained among phytotoxicity tests, soil enzyme activity and Photobacterium phosphoreum ecotoxicity tests. The results showed that the application of a mixed bacterial consortium was illustrated to effectively remediate oil-contaminated soil due to the high TPH removal efficiency, which reduced the crude oil concentration from 5 000 mg·kg-1soil to 1 781 mg·kg-1in only 40 d. The maximum inhibition of bacterial luminescence for Photobacterium phosphoreum in the dichloromethane/dimethyl sulfoxide extracts was observed at the initial stage of bioremediation and gradually dropped to normal. Compared with the control group, the chlorophyll a content of Triticum acstivnm L. was significantly inhibited in the different phases of bioremediation. In soils S1, the chlorophyll a content decreased by 39.3% to (1.36±0.04) mg·g-1. A significant negative correlation can be found between soil catalase activity and the residue of petroleum hydrocarbon. The correlation coefficient is -0.973. Soil extract on the 8th day of the bioremediation remained constant at a relative luminosity of 18.1%, with toxicity equivalent to that of 0.187 mg·L-1HgCl2. Therefore, bacterial luminescence, phytotoxicity (inhibition of chlorophyll a and carotene contents), and soil catalase activity could potentially be sensitive indicators to evaluate the effectiveness of bioremediation techniques.

oil contaminated soil; bioremediation; Photobacterium phosphoreum; combined-bioindicators

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.09.021

X171.5；X172

A

1674-5906（2015）09-1560-10

沈偉航，朱能武，尹富華，王華金，黨志. 微生物修復石油污染土壤的生態毒性指示[J]. 生態環境學報, 2015, 24(9): 1560-1569.

SHEN Weihang, ZHU Nengwu, YIN Fuhua, WANG Huajin, DANG Zhi. Study on Combined Bioindicators in Ecotoxicity Monitoring of Oil-contaminated Soil during Bioremediation [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(9): 1560-1569.

廣東省自然科學基金團隊項目（9351064101000001）；教育部新世紀優秀人才支持計劃項目（NCET-11-0166）

沈偉航（1988年生），男，碩士，主要研究方向為生態毒理與生物指示。Email: shen.wh@mail.scut.edu.cn *通訊作者。朱能武，E-mail: nwzhu@scut.edu.cn

2015-07-08