菰黑粉菌分離方法的研究

曹乾超，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州，310018）

茭白（Zizania latifolia）為禾木科菰屬多年生宿根草本植物，廣泛種植于太湖一帶的江蘇、浙江兩省[1]。作為我國僅次于蓮藕的第二大水生蔬菜，茭白具有很高的經濟價值和營養價值。分析表明，茭白膨大的肉質莖內含有較多蛋白質、膳食纖維及鉀、鈉、鎂等元素[2]。除此之外，茭白還含有一些藥用成分，對高血壓、心臟病等的防治大有裨益[3]。茭白孕茭是茭白植株與專一性寄生在其體內的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）共同作用的結果。形成的可食用肉質莖為正常茭，另有肉質莖內布滿褐色孢子堆為灰茭[3，4]。研究表明，寄生于正常茭和灰茭的菰黑粉菌屬于兩種不同類型，其中與正常茭白共生的菰黑粉菌為MT（mycelia-teliospore）型，多以菌絲形態存在；而侵染灰茭的菰黑粉菌為T（teliospore）型[3]，其菌絲潛育期較短。由于灰茭中布滿菰黑粉菌孢子堆，故分離灰茭中的菰黑粉菌方法比較成熟，常通過挑取菰黑粉菌孢子堆并稀釋涂布的方法[5～7]進行分離培養。而正常茭白中菰黑粉菌多以菌絲態存在，分離較為困難，目前尚未有詳細的分離方法報道。

菰黑粉菌的分離是研究菰黑粉菌種群與茭白品種表型相關性以及茭白孕茭機制的基礎，因此建立標準、快速、有效的菰黑粉菌分離方式具有重要意義。本研究分別采用切片、研磨兩種方法從正常茭白中分離得到菰黑粉菌，通過擴增其ITS-5.8S rDNA序列進行鑒定，并對2種分離方法進行比較，結果表明，2種方法均能分離得到菰黑粉菌，但是對于新鮮組織，研磨法分離效率較高，而對于放置較久的樣品，切片方法可以更好地控制雜菌污染，所以可以根據茭白組織的新鮮程度選擇合適的分離方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以浙江茭白品種龍茭2號正常茭為試驗材料。

1.2 試劑

Taq 酶、dNTP、10×PCR buffer、pMD19-T Vector、solutionⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司，真菌DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、羧芐青霉素、卡那青霉素均購自生工生物工程（上海）有限公司，大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。

1.3 培養基

YEPS雙抗固體培養基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，蔗糖20 g，加蒸餾水溶解后定容至1 000 mL，分裝，每100 mL液體培養基中加入1.5 g瓊脂，高壓滅菌，使用過程中加入羧芐青霉素和卡那霉素至終濃度為100 ng/mL。

1.4 試驗方法

①菰黑粉菌的分離 剝掉新鮮茭白肉質莖外包裹的葉鞘，流水沖洗，再用蒸餾水沖洗，晾干。在超凈工作臺上，按無菌操作方法進行以下操作：先在無菌濾紙上將茭白切成適宜大小，用75%乙醇浸泡30 s，再放入無菌水中洗滌30 s，用無菌濾紙吸干水分，切去外皮，保留白嫩部分。

a.切片分離法將白嫩組織切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的薄片，貼在YEPS雙抗培養基上，每皿貼8～10片，用封口膜將培養皿密封，先正置于28℃恒溫培養箱中，2～3 h后倒置培養。

b.研磨分離法將白嫩組織切成薄片，取4～5片置于滅菌研缽中，加入1 mL滅菌水，將組織研碎，吸取200 μL汁液均勻涂布于YEPS雙抗培養基上，用封口膜將培養皿密封，倒置于28℃恒溫培養箱中培養。

②形態鑒定 待YEPS雙抗培養基上長出菌株后，肉眼觀察菌落形態，同時用牙簽挑取菌落置于無菌水中，取10 μL菌液置光學顯微鏡下觀察。

③分子鑒定 a.基因組DNA的提取。挑取純培養物在YEPS固體培養基上劃線，3 d后，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

b.ITS-5.8S rDNA序列的PCR擴增。應用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增兩種方法分離得到菌株的ITS-5.8S rDNA，引物由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成（表1）。

PCR 反應體系為：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Primer ITS1 1 μL，Primer ITS4 1 μL，template 1 μL，Taq 酶 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應程序為94℃4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃ 10 min；4℃ forever。

c.瓊脂糖凝膠電泳。向PCR擴增產物中加入適量6×loading buffer，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀觀察并拍照。

d.TA克隆及序列分析。將目的條帶割膠回收，回收產物與pMD19-T載體連接，連接體系為：回收產物 4.5 μL，solutionⅠ5 μL，pMD19-T 0.5 μL。連接產物轉化感受態 DH5α，37℃培養 12～14 h后，挑取單菌落，進行菌落PCR驗證。將含有目的基因的菌液送至杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行序列測定，測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對。

表1 引物ITS1和ITS4的序列信息

2 結果與分析

2.1 菰黑粉菌的分離及形態特征

①切片分離法 在YEPS雙抗培養基上培養4～5 d后茭白組織開始呈現褐色，7～9 d后，茭白切片與平板接觸面處長出淡黃色的菌落（圖1）。

②研磨分離法 在YEPS雙抗培養基上培養5 d后，肉眼即可觀察到微小的菌落形成，培養7～9 d后長出淡黃色菌落伴有向四周延伸的白色菌絲（圖1）。

挑取菌落至新的YEPS雙抗培養基上，28℃純化培養，2～3 d后長出淡黃色菌落，4 d后菌落周圍長出白色菌絲（圖2A），顯微鏡下觀察發現菰黑粉菌存在2種形態：一種為酵母型，短桿狀，芽殖；一種為菌絲型，中間部分呈透明狀（圖2B）。

圖1 切片、研磨法分離菰黑粉菌示意

圖2 菰黑粉菌形態觀察

2.2 菰黑粉菌的分子鑒定

將用切片法和研磨法分離得到的菌株提取DNA，對其ITS-5.8S rDNA序列進行擴增克隆并測序，擴增片段大小均在750 bp左右，結果見圖3。測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，結果表明，與菰黑粉菌（序列號：AB211915.1）的相似度為96%，具有較高同源性，可認定為菰黑粉菌。新鮮程度，根據不同的樣品選擇合適的方法。

茭白的產生與菰黑粉菌的侵染密切相關，因此對菰黑粉菌的研究將有利于明確茭白的孕茭機理及灰茭的形成機制。在分離得到菰黑粉菌的基礎上，后續能夠有效地針對菰黑粉菌展開相關試驗，從而揭示菰黑粉菌的種群特點及其在茭白植株中的作用機制。

圖3 菰黑粉菌ITS-5.8S rDNA序列擴增

3 討論與結論

傳統的真菌鑒定主要從真菌的孢子形態、菌落特征、生理生化特征等方面進行，而真菌種類繁多，這些早已無法滿足真菌分類鑒定的需求。隨著現代分子生物學的發展，基于rDNA-ITS多態性的序列分析成為真菌分類及鑒定研究的熱點[8，9]。由于真菌通用引物ITS1和ITS4既能擴增內轉錄間隔區ITS1和ITS2，又能擴增其間高度保守的5.8S rDNA，廣泛應用于真菌的分子鑒定。

植物內生真菌的分離方法有很多，針對不同的內生真菌各有不同[10]。目前對菰黑粉菌的研究剛剛起步，其分離方法尚不成熟。本研究采用切片、研磨2種方法從新鮮的正常茭中分離菰黑粉菌，經形態及分子生物學方法鑒定為菰黑粉菌。試驗過程中應當注意，正常茭白組織最好是新鮮的。另外，試驗過程中發現，新鮮的茭白組織通過研磨更容易分離出菰黑粉菌；若茭白組織長時間放置，茭白表面容易孳生霉菌，研磨分離容易污染，而切片分離法則能夠較好的分離。因此，在試驗中應當注意試驗樣品

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