蘿卜抗黑腐病、黑斑病和根腫病育種相關基礎研究

甘彩霞，袁偉玲，崔磊，王晴芳，於校青，鄧曉輝

（湖北省農科院經濟作物研究所，武漢，430070）

“十二五”期間湖北省農科院經作所在蘿卜抗黑腐病、黑斑病和根腫病育種上開展了相關基礎研究，為后續抗性資源的利用、抗性遺傳規律的研究以及分子標記的開發進行了技術儲備。

1 蘿卜黑腐病抗病育種相關基礎研究

1.1 蘿卜主產區病原菌的分離鑒定

①柯赫氏法則回接驗證 采集蘿卜主產區黑腐病病樣，采用稀釋涂布分離法在NYGA平板培養基上分離培養病原菌。采用苗期活體噴霧接種和蘿卜塊離體涂抹接種2種方法回接病菌，葉片出現了水漬狀“V”字形斑與田間癥狀相似，蘿卜塊出現黑腐癥狀，說明采集的菌株均為黑腐病病原菌，然后從中選擇致病力強的菌株進行后續試驗。

②16S rDNA序列分析與Biolog細菌自動鑒定系統測定 將測得的WHHF菌株的16S rDNA序列與GenBank中的核酸數據進行比對，選取同源性較高的序列。WHHF菌株16S rDNA序列與油菜黃單胞桿菌油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestris（Pammel）Dowson同源性極高，達到了99%，進一步明確了WHHF菌株屬于油菜黃單胞桿菌油菜致病變種。

應用Biolog細菌自動鑒定系統測定菌株，將結果經計算機處理后與數據庫內已知的細菌比較，分析后進一步確認驗證該菌株為油菜黃單胞桿菌[1]（Xanthomonas campestrispv.campestris）。

1.2 抗性種質篩選

蘿卜黑腐病多從葉緣水孔或傷口侵入[2]，基于侵染發病條件設計可分為活體接種或離體接種?；铙w噴霧接種適于多份種質資源需要快速檢測其苗期抗病，重復多、接種量大時采用；離體菌液注射接種適于少量試驗材料且發病條件易于控制時采用，可為噴霧接種初篩材料后的補充，采用該接種方法要求發病條件更加均勻一致。

①苗期噴霧接種 基于蘿卜黑腐病侵染為葉緣水孔侵入，采用苗期噴霧接種法，即在光照培養室內（25～30℃），選擇濃度為 1.0×108cfu/mL 的細菌懸浮液采用噴霧法于蘿卜5～6片葉期接種，保濕24 h，7 d后調查病情，評價蘿卜品種對黑腐病的抗性[3]。

噴霧法分級標準：0級：無?。?.1級：葉上有一個小斑；0.5級：葉上有幾個病斑，或一個較大的病斑；1級：葉上發病區占葉面積的 1/4；2級：葉上發病區占葉面積的 1/2；3級：葉上發病區占葉面積的3/4；4級：病區占葉面積 3/4以上至全葉。

按病情分級調查后，計算病情指數，根據發病程度對抗病性分級。免疫（I）：病情指數=0；高抗 （HR）：0＜病情指數≤10； 抗病 （R）：10＜病情指數≤20； 中抗（MR）：20＜病情指數≤40；感?。⊿）：病情指數＞40。

利用該鑒定方法，對蘿卜42份種質資源進行了抗病性鑒定和分級，其中，有6份材料表現為抗病，18份表現為抗性中等，其余18份均表現為不抗病。

②蘿卜塊離體接種 基于蘿卜黑腐病侵染可從傷口侵入，且蘿卜為根菜類作物，采用蘿卜塊離體接種方法，即在蘿卜塊中間用移液槍加上1×108cfu/mL菌液，蓋玻片將菌液均勻涂滿蘿卜塊，接種后48 h調查病情指數。

病情指數分級標準：0級：無癥狀；1級：在蘿卜塊上有水漬變黃癥狀；3級：病斑變成黃褐色并伴隨腐爛癥狀；5級：病斑腐爛面積擴大并深入蘿卜塊中；7級：病斑變成黑褐色；9級：蘿卜塊完全黑腐萎蔫。

按病情分級調查后，計算病情指數，根據發病程度對抗病性分級[1]。免疫（I）：病情指數=0；高抗（HR）：0＜病情指數≤10；抗病 （R）：10＜病情指數≤20；中抗（MR）：20＜病情指數≤40；感病（S）：病情指數＞40。

由表1可見，13份高代自交系沒有抗病材料，中抗材料有2份，其他均為感病和高感材料。

2 蘿卜黑斑病抗病育種相關基礎研究

2.1 蘿卜主產區病原菌的分離鑒定

采集蘿卜主產區黑斑病病樣，分離病健交接部位在PDA平板培養基上培養，顯微鏡下挑取單孢進行分離培養。對比參照十字花科鏈格孢形態確定致病菌為蘿卜鏈格孢，采用苗期活體噴霧接種和蘿卜葉片離體菌餅接種2種方法回接病菌，活體葉片出現了輪紋狀黑斑與田間癥狀相似，蘿卜塊出現侵染癥狀[4]，說明采集的菌株均為黑斑病病原菌，然后選擇致病力強且產孢量多的菌株WHHB1進行后續試驗。

2.2 黑斑病病原菌發病條件確定研究

研究結果表明，豆芽培養基是產孢最佳的培養基；菌株在15℃培養時孢子萌發率最高，在0℃時萌發率最低；在第4～7天菌絲生長較快，第10～13天菌絲生長較慢；菌株在日光燈照射下培養2 h產孢量增多，照射培養24 h產孢量減少。該結論對生產中黑斑病的發病侵染控制有一定的參考作用，生產田間若有黑斑病發生，而此時溫度在15℃左右，則侵染的第4～7天是發病最快的時間段，應在此期對黑斑病進行預防和控制，效果較佳[5]。

2.3 抗性種質篩選

選擇30 d苗齡、健壯且長勢一致的蘿卜植株，取其第3、4片真葉，選擇濃度為1.0×105個孢子/mL的菌株孢子懸浮液噴霧接種于離體葉片，在室內溫度25～30℃，保濕5 d后調查病情指數。

按0～9級標準進行發病程度調查。0級：無癥狀；1級：接種葉生褐色小點，無褪綠斑；3級：接種葉生3 mm以下的褪綠斑，無霉層；5級：接種葉生3 mm以上的褪綠斑，有極少霉層，病斑不連成片；7級：接種葉生5 mm以上的褪綠斑，有較多的霉層，病斑連成片；9級：接種葉病斑連成片，大面積枯死，霉層明顯。

抗病性分級標準參照李樹德[6]的方法：免疫（I）：病情指數 0；高抗（HR）：0.1≤病情指數≤11.11；抗病 （R）：11.12≤ 病 情 指 數 ≤33.33； 中 抗 （MR）：33.34≤病情指數≤55.55；感?。⊿）：55.56≤病情指數≤77.77；高感（HS）：77.78 以上。

由表1可見，13份高代自交系有1份抗病材料，6份中抗材料，其他6份均為感病材料。

3 蘿卜根腫病抗病育種相關基礎研究

病原菌為沈陽農業大學提供的根腫病4號生理小種。所有材料均用根腫病4號生理小種接種，子葉期至1葉期以2×107個孢子/mL的濃度灌根接種幼苗，接種后第6周調查發病情況。

蘿卜抗根腫病病情指數分級標準如下：0級：無根瘤；1級；須根上有幾個零散的小根瘤；3級：有較大根瘤，且癥狀明顯；5級：主要根系上有較多聚集根瘤。

由表2可見，后續試驗初步定為露頭青、喜諾青為感病備選材料；白將軍、217早太郎、石莊白、美儂為抗病備選材料。

另利用灌根法對種質資源及59份品種篩選，其中有31份材料抗病，可為后續抗性資源作儲備。

表1 13份高代自交系抗WHHF和抗WHHB1菌株接種后48 h病情指數

4 討論與結論

①在蘿卜抗黑腐病篩選方法上，針對噴霧接種、剪葉接種、葉柄注射接種和蘿卜塊涂抹接種均進行了試驗，每種方法各有所長，也各有缺陷。噴霧接種最接近大田自然發病條件，但若菌原正好從水孔侵入則發病，未侵入時不能代表材料不會感染發病，發病不均勻，需多次反復接種，盡可能使病原菌侵染均勻一致；剪葉接種因剪葉截面積小，菌種濃度控制不均勻，也會導致發病不均勻；葉柄注射接種和蘿卜塊涂抹接種因取材部位不同，抗病性有不一致現象，考慮到蘿卜屬于根菜類，進行蘿卜塊接種更接近產品器官[1]。研究重點采用蘿卜塊離體涂抹接種進行抗性篩選，13份高代自交系篩選結果為沒有抗病材料，有2份中抗材料，其他為感病和高感材料。結合田間進行抗性種質篩選，由于大田環境因素難以控制，接種后發病不均勻，且多年多次接種結果均不一致，不建議采用此方法進行接種。

②在蘿卜抗黑斑病篩選方法上，針對噴霧活體接種、噴霧離體葉片接種和菌餅離體接種均進行了試驗，每種方法各有所長，也各有缺陷。噴霧接種最接近大田自然發病條件，且活體存活期長，利于更持久的侵染觀察，但接種需反復多次，避免接種不均勻而導致發病不均勻，盡可能使病原菌侵染均勻一致；噴霧離體葉片接種便于控制環境溫濕度，且接種鑒定周期短，節省鑒定空間，取樣后種質材料可以繼續生長進行田間其他試驗或者留種；菌餅離體接種與離體葉片噴霧接種類似，便于控制環境溫濕度，節省空間，但與孢子接種不同，菌餅接種更易因菌株產生毒素而侵染離體葉片，需要更多的試驗進行分析。研究重點采用噴霧離體葉片接種進行抗性篩選，13份高代自交系篩選結果為有1份抗病材料、6份中抗材料、6份為感病材料。本研究結合田間進行抗性種質篩選，由于大田環境因素難以控制，接種后發病不均勻，且多年多次接種結果均不一致，不采用此方法進行接種。

表2 13份高代自交系抗根腫病篩選結果

③十字花科根腫病相關研究很多，研究當中直接利用已知的4號生理小種進行篩選，針對接種方法的篩選前人開展了相關研究，在此不再贅述，研究當中采用的灌根法進行接種，獲得的抗、感備選材料進行群體構建、分子標記的開發。

④研究篩選的抗、感材料，啟動了遺傳群體的構建工作，結合表型驗證進行抗性位點QTL定位，篩選多態性標記，為種質資源的分子標記輔助育種和種質資源創新打下基礎。

[1]甘彩霞，鄧曉輝，袁偉玲，等.武漢蘿卜主產區十字花科黑腐病病原菌鑒定及蘿卜抗性種質篩選[C]//中國園藝學會十字花科蔬菜分會第十二屆學術研討會論文集，2014：148-153.

[2]呂佩珂，蘇慧蘭，高振江，等.中國現代蔬菜病蟲原色圖鑒[M].內蒙古：遠方出版社，2008：523.

[3]甘彩霞，何云啟，崔磊，等.蘿卜黑腐病苗期抗病性鑒定方法的研究[J].湖北農業科學，2010，49（12）：3 057-3 060.

[4]甘彩霞，祝花，崔磊，等.蘿卜黑斑病苗期室內抗病性鑒定方法研究[J].湖北農業科學，2013，52（19）：4 645-4 647.

[5]甘彩霞，袁偉玲，王晴芳，等.蘿卜黑斑病菌JZHB_7菌株的生物學特性及培養基的篩選[J].湖北農業科學，2014，53（10）：2 312-2 315.

[6]李樹德.中國主要蔬菜抗病育種進展[M].北京：科學出版社，1995.