基于鎖核苷酸（LNA）增敏的植煙土壤中煙草黑脛病菌定量PCR檢測(cè)方法

劉 芳，宋紀(jì)真，范藝寬，牟文君，奚家勤*，胡利偉*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2.中國(guó)煙草總公司河南省公司，鄭州市政七街7號(hào) 450008

基于鎖核苷酸（LNA）增敏的植煙土壤中煙草黑脛病菌定量PCR檢測(cè)方法

劉 芳1，宋紀(jì)真1，范藝寬2，牟文君1，奚家勤*1，胡利偉*1

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2.中國(guó)煙草總公司河南省公司，鄭州市政七街7號(hào) 450008

為了快速有效地檢測(cè)植煙土壤中的煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量，以一種鎖核苷酸（LNA）引物為基礎(chǔ)，進(jìn)行了植煙土壤中煙草黑脛病菌數(shù)量的定量PCR檢測(cè)方法研究。結(jié)果表明：①與普通DNA引物相比，LNA引物提高了PCR反應(yīng)的退火溫度，減少了引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成，提高了煙草黑脛病菌分子檢測(cè)的靈敏度與特異性；②定量分析檢測(cè)出14個(gè)煙草-大蒜輪作土樣中煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量為2.76×103～5.20×104個(gè)/g，且在4～5 h內(nèi)完成檢測(cè)，具有較高的靈敏度和檢測(cè)效率。

植煙土壤；煙草黑脛病菌；鎖核苷酸（LNA）；熒光定量PCR；分子檢測(cè)

煙草黑脛病是一種毀滅性的土傳真菌病害，由寄生疫霉煙草變種（Phytophthora parasitic var.nicotianae）引起，在我國(guó)許多產(chǎn)煙區(qū)尤其是北方煙區(qū),如安徽、山東和河南等省發(fā)病較重，給煙葉生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失［1-3］。由于煙草黑脛病的發(fā)病率高、分布范圍廣、造成的經(jīng)濟(jì)損失大，因此對(duì)其進(jìn)行快速有效診斷和檢測(cè)一直是病害防治工作的重點(diǎn)和前提［4］。植煙土壤中的黑脛病菌定殖量直接影響煙區(qū)的煙草黑脛病發(fā)病率，所以檢測(cè)植煙土壤中的黑脛病菌定殖量對(duì)預(yù)測(cè)煙草黑脛病的發(fā)生具有重要意義。由于土壤微生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，雜菌種類繁多，給檢測(cè)工作帶來(lái)了很大的困難，因此需要高靈敏度和高特異性的檢測(cè)方法對(duì)土壤中煙草黑脛病菌的定殖量進(jìn)行有效檢測(cè)。近年來(lái)，PCR技術(shù)尤其是熒光定量PCR技術(shù)為快速、準(zhǔn)確和靈敏地定量檢測(cè)微生物數(shù)量提供了有效手段［5］。謝勇等［6］合成了一對(duì)17 bp的特異性寡聚核苷酸引物，采用普通PCR可對(duì)煙草黑脛病菌進(jìn)行快速檢測(cè)；Ippolito等［7］和Blaya等［8］曾先后采用Real-time PCR對(duì)土壤中的煙草黑脛病菌進(jìn)行了定性或定量分析，并取得了一定效果。隨著分子檢測(cè)方法的改進(jìn)，相應(yīng)PCR引物的設(shè)計(jì)也引起了人們的重視。一種被命名為鎖核苷酸（Locked Nucleic Acid，LNA）［9］的新型寡核苷酸衍生物應(yīng)運(yùn)而生，其結(jié)構(gòu)中的β-D-呋喃核糖的2’-O、4’-C位點(diǎn)可通過(guò)縮水形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，如氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋等，這種結(jié)構(gòu)能夠鎖定呋喃糖的N構(gòu)型，一定程度上降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了核酸鏈之間雜交的穩(wěn)定性［9-12］。國(guó)外有報(bào)道表明，LNA修飾后能夠顯著增強(qiáng)寡核苷酸與DNA模板的結(jié)合能力，與普通DNA引物相比，LNA引物能夠提高PCR的特異性和靈敏性［13-14］；并且在相對(duì)更寬泛的PCR退火溫度范圍內(nèi)，LNA引物仍可以保持很高的擴(kuò)增效率［15］。這種LNA引物已經(jīng)應(yīng)用于許多分子檢測(cè)體系中，但在煙草黑脛病菌的檢測(cè)和診斷方面則未見(jiàn)報(bào)道。為此，通過(guò)對(duì)比煙草黑脛病菌特異性普通DNA引物及堿基修飾后的LNA引物的反應(yīng)條件，探討LNA引物對(duì)PCR擴(kuò)增的影響，并采用熒光定量PCR檢測(cè)植煙土樣中煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量，旨在建立一種鎖核苷酸（LNA）增敏的植煙土壤中煙草黑脛病菌定量PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試感病煙株采集于洛陽(yáng)煙區(qū)；供試土樣采集于駐馬店煙區(qū)的煙草-大蒜輪作的田塊。

燕麥培養(yǎng)基［16］、含氨芐的LB培養(yǎng)基均在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)現(xiàn)用現(xiàn)配；土壤病原菌DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)MOBIO公司，PCR試劑購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；pMD18-T載體、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DH5α感受態(tài)大腸桿菌、質(zhì)粒小量提取試劑盒、SYBR Green I均購(gòu)自日本TaKaRa公司；引物合成和測(cè)序由美國(guó)Invitrogen公司和生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 病原菌的分離及培養(yǎng)

將感黑脛病煙株的莖部沖洗干凈，用滅菌刀將莖部剖開(kāi)，從病健交界處取大約3 mm×3 mm的碟片狀髓部組織，依次通過(guò)NaClO、75%乙醇進(jìn)行表面消毒，經(jīng)無(wú)菌水漂洗2～3次。將漂洗過(guò)的組織用無(wú)菌濾紙吸干后接種到燕麥培養(yǎng)基上，放入恒溫箱中28℃下對(duì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并將純化后的菌株保藏到4℃冰箱中。

1.2.2 菌株和土壤病原菌DNA的提取

采用POWERSOIL DNA提取試劑盒進(jìn)行土壤黑脛病菌DNA的提取，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用CTAB（十三烷基三乙基溴化銨）法提取煙草黑脛病菌菌絲DNA［17］。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與篩選

通過(guò)查閱文獻(xiàn)［18］和相關(guān)生物信息學(xué)分析［19］，獲得煙草黑脛病菌獨(dú)特的5.8S核糖體RNA及其相鄰的ITS區(qū)域，采用Primer Express 2軟件設(shè)計(jì)引物,見(jiàn)表1。運(yùn)用常規(guī)PCR進(jìn)行引物特異性檢測(cè)，總反應(yīng)體系 25 μL，包括 10×PCR buffer 2.5 μL ；1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP 混合液；0.2 μmol/L引物；25 ng DNA模板，最后加ddH2O補(bǔ)至25 μL。陰性對(duì)照為ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

LNA引物的設(shè)計(jì)：引物的LNA修飾對(duì)PCR反應(yīng)的影響主要取決于LNA修飾的位置、數(shù)量和引物本身的序列長(zhǎng)度，其中以在引物序列中間位置相距大約4～6個(gè)堿基的兩個(gè)堿基位點(diǎn)進(jìn)行修飾的效果較好［20］。綜合考慮引物的設(shè)計(jì)原則及其特異性，對(duì)引物Pn3R/Pn3F兩個(gè)位置的堿基進(jìn)行修飾。正向引物：5'-TGAACGCATATTGCACTTCC-3'，反向引物：5'-GACAAACCAGTCGCCAATTT-3'（下劃線字母為L(zhǎng)NA堿基）。

表1 煙草黑脛病檢測(cè)的相關(guān)引物

1.2.4 LNA引物PCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化

總反應(yīng)體系 25 μL：10×buffer 2.5 μL；1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP混合液；0.2 μmol/L的LNA引物；25 ng黑脛病菌DNA模板，加ddH2O補(bǔ)至25 μL，陰性對(duì)照為ddH2O。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 30 s，分別以55.0、55.8、57.4、59.7、62.6、65.0和66.3 ℃的退火溫度退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及土壤樣品中煙草黑脛病菌定殖數(shù)量的檢測(cè)

煙草黑脛病菌5.8S核糖體RNA及其相鄰的ITS區(qū)域克隆：使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)1.2.3節(jié)中采用Pn3R/Pn3F進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。然后將4 μL純化產(chǎn)物與1 μL pMD18-T載體混合，加入5 μL連接溶液I（日本TaKaRa公司），連接體系為10 μL，16 ℃保溫12 h。取連接產(chǎn)物10μL與100 μL DH5α感受態(tài)大腸桿菌菌液混合均勻，冰浴25 min，42℃熱激45 s。接著將菌液涂布到含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的 LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取白斑進(jìn)行PCR鑒定，然后挑取陽(yáng)性克隆置于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，并于37℃振蕩培養(yǎng)箱中200 r/min振蕩16 h后，取1.5 mL菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。

標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：按照試劑盒說(shuō)明書，使用質(zhì)粒小量提取試劑盒從過(guò)夜培養(yǎng)的菌液中提取質(zhì)粒，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定濃度，然后進(jìn)行拷貝數(shù)換算。將質(zhì)粒溶液用ddH2O稀釋，分別稀釋成1×102～1×106個(gè)/μL 5個(gè)梯度作為模板（稀釋時(shí)用移液槍吹打15次，振蕩10 s，保證溶液充分混勻）。

同時(shí)對(duì)提取的14個(gè)土壤黑脛病菌DNA和不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品一起進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量PCR反應(yīng)于瑞士羅氏公司的LightCycler?480 Instrument II上進(jìn)行。熒光定量PCR 反應(yīng)總體系為 25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物各0.3 μmol/L，模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)到25 μL。每個(gè)樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，50個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)與篩選

對(duì)提取的4個(gè)不同的土壤黑脛病菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果（圖1）表明：3對(duì)引物均可以擴(kuò)增出長(zhǎng)度大小不同的特異性條帶，但是靈敏度存在差異，引物Pn3R/Pn3F的靈敏度最高，Pn2R/Pn2F次之，Pn1R/Pn1F的靈敏度相對(duì)較弱。對(duì)擴(kuò)增效果最好的一對(duì)引物Pn3R/Pn3F的PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明Pn3R/Pn3F的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)自黑脛病菌，擴(kuò)增的煙草黑脛病菌特異性目的條帶大小為251 bp。

圖1 3對(duì)引物對(duì)黑脛病菌DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 引物Pn3R/Pn3F的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序序列

2.2 LNA引物的PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

在相同的PCR反應(yīng)體系及退火溫度下對(duì)黑脛病菌菌絲DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并將DNA引物與LNA引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖3。從電泳結(jié)果可以看出，在55～57℃的退火溫度條件下LNA引物的擴(kuò)增效率稍高，但不顯著。當(dāng)退火溫度提高到60℃以上時(shí)，普通DNA引物的擴(kuò)增效率急劇下降且不穩(wěn)定，甚至在66℃的退火溫度下沒(méi)有特異性條帶產(chǎn)生。而在相同的PCR反應(yīng)條件下，LNA引物的適宜退火溫度范圍更廣，在55～66℃均可以擴(kuò)增出目的條帶，而普通DNA引物的適宜退火溫度范圍相對(duì)較窄。較高的退火溫度能夠減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成，與DNA引物相比，LNA引物不僅提高了煙草黑脛病菌分子檢測(cè)的靈敏度，還提高了檢測(cè)的特異性。

圖3 不同退火溫度下LNA引物與DNA引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將提取的含有目的片段的原始質(zhì)粒懸液的濃度單位換算成個(gè)數(shù)單位，進(jìn)行稀釋后得到1.0×102～1.0×106個(gè)/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度梯度，并以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，利用質(zhì)粒的濃度對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值（Ct）生成擴(kuò)增反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4A表明煙草黑脛病菌DNA的10倍稀釋液均有明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物生成；圖4B的熔解曲線只在83～84℃之間出現(xiàn)了一個(gè)峰值，驗(yàn)證了本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的LNA引物具有高度特異性；圖4C為本試驗(yàn)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程Y=-3.675 0X+40.876，R2=0.999 6，相關(guān)性較好，表明所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有可靠性和合理性，反應(yīng)效率為1.831，可滿足定量PCR分析的要求。這些數(shù)據(jù)表明試驗(yàn)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線適用于植煙土壤中煙草黑脛病菌定殖數(shù)量的分析。

圖4 不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒懸液的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 土壤DNA的熒光定量PCR反應(yīng)

將提取的土壤病原菌DNA同時(shí)與不同濃度梯度的質(zhì)粒懸液同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR分析，待測(cè)土樣的黑脛病菌定殖數(shù)量可以根據(jù)其所測(cè)得的Ct值從直線回歸方程中計(jì)算得到。擴(kuò)增結(jié)果（圖5）表明：圖5A中樣本的熒光強(qiáng)度隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增加而增加，可以看出所有的土樣DNA均有明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物生成，不同的土樣中黑脛病菌的定殖量存在差異；圖5B表明該引物對(duì)提取的土壤DNA擴(kuò)增反應(yīng)的特異性高，證明了擴(kuò)增結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。本試驗(yàn)中采用試劑盒對(duì)0.25 g土壤進(jìn)行病原菌DNA提取，獲得100 μL DNA溶液，取1 μL進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，將得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到1μL模板中煙草黑脛病菌的數(shù)量，計(jì)算得出采集的供試土樣1g土壤中的煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量為2.76×103～5.20×104個(gè)，見(jiàn)表2。

圖5 14個(gè)植煙土壤黑脛病菌DNA樣品的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2 供試土壤中煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量

3 結(jié)論與討論

將LNA引物運(yùn)用于煙草黑脛病菌數(shù)量的定量PCR檢測(cè)中，建立了一種LNA增敏的檢測(cè)植煙土壤中黑脛病菌數(shù)量的定量PCR檢測(cè)方法。該方法以煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）中的5.8S核糖體RNA及其相鄰的ITS區(qū)域片段設(shè)計(jì)多對(duì)DNA引物，選擇擴(kuò)增效率較好的一對(duì)引物（Pn3R/Pn3F）對(duì)其堿基修飾得到LNA引物，提高了引物的特異性和靈敏度。本試驗(yàn)中的供試土壤為煙草-大蒜輪作地塊的土壤，利用設(shè)計(jì)的LNA引物對(duì)14個(gè)植煙土樣進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，可以檢測(cè)到土壤中黑脛病菌的定殖數(shù)量，證明在復(fù)雜的土壤環(huán)境中也可以有效地進(jìn)行檢測(cè)，成功構(gòu)建了一種基于LNA增敏的植煙土壤中黑脛病菌數(shù)量的定量PCR檢測(cè)方法。

該方法適用于復(fù)雜土壤中煙草黑脛病菌定殖數(shù)量的檢測(cè)，但本試驗(yàn)中所選擇的材料僅來(lái)自河南省部分煙區(qū)，試驗(yàn)材料尚不充分，而且LNA增敏的熒光定量PCR方法目前只針對(duì)植煙土壤中黑脛病菌定殖數(shù)量的檢測(cè)進(jìn)行了試驗(yàn)。從理論上分析，該方法同樣適用于煙草植株、病株殘?bào)w中黑脛病菌定殖數(shù)量的檢測(cè)，但尚有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，另外在擴(kuò)大試驗(yàn)材料范圍如供試樣品的采集地和病原菌的寄主范圍方面也有待進(jìn)一步研究。

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A Quantitative PCR Method for Detecting Phytophthora parasitica var.nicotianae in Tobacco Planting Soil Based on LNA Sensitization

LIU Fang1,SONG Jizhen1,FAN Yikuan2,MOU Wenjun1,XI Jiaqin*1,and HU Liwei*1
1.Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China
2.Henan Province Company of CNTC,Zhengzhou 450008,China

In order to efficiently detect the colonization of Phytophthora parasitica var.nicotianae in tobacco planting soil,a quantitative PCR method was researched based on locked nucleic acid（LNA）primer.The results showed that:1）Comparing with conventional DNA primers,the LNA primer raised PCR reaction annealing temperature,reduced the formation of primer dimers and non-specific products,and improved the sensitivity and specificity of detection.2）LNA quantitative PCR analysis revealed that the concentration of Phytophthora parasitica var.nicotianae in 14 soil samples of tobacco/garlic rotation fields ranged from 2.76×103to 5.20×104per gram.This method is sensitive and efficient,the detection can be completed within 4-5 hours.

Tobacco planting soil;Phytophthora parasitica var.nicotianae;Locked nucleic acid（LNA）;Fluorescence quantitative PCR;Molecular detection

S43

A

1002-0861（2015）12-0014-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151203

2015-01-19

2015-05-06

中國(guó)煙草總公司河南省公司科技項(xiàng)目“煙草黑脛病防控關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用”（122013DS0320）。

劉芳（1992—），女，在讀碩士研究生，研究方向：煙草農(nóng)業(yè)。E-mail：qqfliu@163.com；*

奚家勤，E-mail：xijq@ztri.com.cn；胡利偉，E-mail：lwhu2003@hotmail.com

劉芳，宋紀(jì)真，范藝寬，等.基于鎖核苷酸（LNA）增敏的植煙土壤中煙草黑脛病菌定量PCR檢測(cè)方法［J］.煙草科技，2015，48（12）：14-19.LIU Fang,SONG Jizhen,FAN Yikuan,et al.A quantitative PCR method for detecting Phytophthora parasitica var.nicotianae in tobacco planting soil based on LNA sensitization［J］.Tobacco Science&Technology,2015,48（12）：14-19.

責(zé)任編輯 董志堅(jiān)